孫正清 蓋成林 蘇芳 楊天德

·論著·

異丙酚對(duì)大鼠腦損傷后腦組織MMP-9表達(dá)的影響

孫正清 蓋成林 蘇芳 楊天德

目的觀察異丙酚對(duì)大鼠腦損傷后腦組織MMP-9表達(dá)的影響，探討異丙酚的腦保護(hù)作用機(jī)制。方法91只雄性Wistar 大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、傷后0.9%氯化鈉溶液組、傷后異丙酚治療組。異丙酚給藥量為臨床麻醉相關(guān)劑量(100 mg/kg)：冷凍傷后15 min腹腔注射異丙酚50 mg/kg，1次/2 h后再次追加相同劑量。采用顱骨外腦冷凍傷法，運(yùn)用液氮冷凍器局部冷凍大鼠左側(cè)頂部腦組織60 s制作冷凍傷即腦損傷模型。分別于冷凍傷后2、6、24 h處死并收集腦組織標(biāo)本，采用干濕重法測(cè)定腦水含量，RT-PCR法檢測(cè)MMP-9基因的mRNA表達(dá)，免疫組化法測(cè)定MMP-9的蛋白表達(dá)。結(jié)果傷后0.9%氯化鈉溶液組在傷后各時(shí)點(diǎn)傷側(cè)腦組織含水量均顯著高于假手術(shù)組(P<0.01)，腦冷凍傷后24 h最高；在傷后6 h、24 h，傷后異丙酚治療組腦組織含水量與0.9%氯化鈉溶液組比較均顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或<0.01)。假手術(shù)組腦組織MMP-9 mRNA水平表達(dá)很低，腦冷凍傷后2 h,0.9%氯化鈉溶液組MMP-9 mRNA水平較假手術(shù)組明顯升高，6 h最高，24 h仍保持在較高水(P<0.01)；在傷后6 h及24 h，傷后異丙酚治療組腦組織MMP-9 mRNA水平與0.9%氯化鈉溶液組比較均顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或<0.01)。假手術(shù)組腦組織MMP-9蛋白未見明顯陽(yáng)性表達(dá)，腦冷凍傷后2 h,0.9%氯化鈉溶液組MMP-9蛋白陽(yáng)性表達(dá)水平較假手術(shù)組明顯升高，6 h最高，24 h仍保持在較高水平(P<0.01)；在傷后6 h及24 h，傷后異丙酚治療組腦組織MMP-9 蛋白表達(dá)水平與0.9%氯化鈉溶液組比較均顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或<0.01)。結(jié)論臨床麻醉相關(guān)劑量的異丙酚可以減輕腦損傷后腦水腫。此種作用可能與異丙酚抑制MMP-9的表達(dá)有關(guān)。

異丙酚;腦創(chuàng)傷;基質(zhì)金屬蛋白酶-9;腦水腫

腦水腫是顱腦損傷最常見、最嚴(yán)重的繼發(fā)損傷之一，也是顱腦損傷患者致死致殘的重要原因。創(chuàng)傷性腦水腫是一種混合型腦水腫。由于血管源性腦水腫在創(chuàng)傷性腦水腫的形成、顱內(nèi)壓增高及繼發(fā)性腦損害中的重要作用，以保護(hù)顱腦損傷后血腦屏障，減輕血管源性腦水腫的救治措施成為備受關(guān)注的課題。近期的研究顯示全麻藥異丙酚可以減輕創(chuàng)傷性腦水腫[1]，降低缺血性腦損傷后血腦屏障通透性，促進(jìn)血腦屏障功能的恢復(fù)[2]。但異丙酚通過何種機(jī)制來達(dá)到此種腦保護(hù)效應(yīng)研究尚少。近期，基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)在血管源性腦水腫的研究中受到廣泛關(guān)注。腦損傷后MMP-9表達(dá)增高，參與血腦屏障破壞及繼發(fā)性腦損害[3，4]。本研究我們采用腦冷凍傷這一經(jīng)典的血管源性腦水腫模型，以異丙酚腹腔注射為干預(yù)，觀察異丙酚對(duì)腦損傷后MMP9的影響，探討異丙酚的創(chuàng)傷性腦保護(hù)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 清潔級(jí)雄性 Wistar 大鼠91 只，體重230 ～250 g，由第三軍醫(yī)大學(xué)大坪野戰(zhàn)外研所提供。隨機(jī)分為假手術(shù)組：只切開頭皮而未行冷凍傷處理；傷后0.9%氯化鈉溶液組：冷凍傷后15 min腹腔注射0.9%氯化鈉溶液5 ml/kg,0.5 h后再次追加相同劑量，根據(jù)觀察時(shí)間不同，分為3個(gè)亞組，即冷凍傷后2、6、24 h組；傷后異丙酚治療組：冷凍傷后15 min腹腔注射異丙酚50 mg/kg，0.5 h后再次追加相同劑量，也分為2、6、24 h 3個(gè)亞組。其中49只用于測(cè)量腦組織含水量及檢測(cè)腦組織MMP-9 mRNA的表達(dá)(假手術(shù)組及每個(gè)亞組均含7只)，42只用于MMP-9免疫組化檢測(cè)(假手術(shù)組及每個(gè)亞組均含6只)。

1.2 動(dòng)物模型制備 參照文獻(xiàn)[5]的方法制備動(dòng)物模型。1%戊巴比妥鈉(45 mg/kg)腹腔麻醉大鼠，待角膜及翻正反射消失后，俯臥位固定于立體定位儀上，碘氟消毒頭部皮膚，沿正中切開頭皮，分離骨膜，暴露左頂顱骨。將內(nèi)盛丙酮的冷凍器直接浸泡入液氮中預(yù)冷，使冷凍器溫度為液氮溫度(-196℃)。將直徑5 mm冷凍頭垂直置于矢狀縫左旁開5.5mm為圓心的骨面上(冷凍頭前緣至冠狀縫)，冷凍60 s，造成左頂葉腦皮層的冷凍傷。手術(shù)室溫度為25℃，術(shù)中電燈泡照射維持肛溫為37～37.5℃。術(shù)畢自由進(jìn)食水。

1.3 腦水含量測(cè)定 采用干濕重法。在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)，大鼠斷頭取腦，去除小腦及腦干，在凍傷灶周圍(距凍傷灶3 mm內(nèi)的左半球后1/2部分)取大小約110 mg腦皮質(zhì)全層組織塊(包括灰質(zhì)和白質(zhì))，以濾紙吸去表面液體，在5 min之內(nèi)用分析天平稱量左右腦組織濕重。之后將其放入52℃的醫(yī)用電烤箱72 h，再分別稱量腦組織干重(2次測(cè)量之差小于0.2 mg)。按Elliott公式計(jì)算腦組織含水量，腦組織含水量(%)=(濕重-干重)/濕重×100%。

1.4 RT-PCR檢測(cè)MMP-9 mRNA的表達(dá) 在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)，大鼠斷頭取腦，在生理鹽水冰面上迅速取凍傷灶周圍(距凍傷灶3 mm內(nèi)的半球前1/2右部分)腦組織，置入液氮中保存待用。取凍傷灶周圍組織50 mg,按RNAex Reagent 說明書提取總RNA。按試劑盒說明書進(jìn)行cDNA第一鏈的合成(逆轉(zhuǎn)錄，RT)，然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增。 PCR引物由上海博亞生物技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)合成。MMP-9引物序列：上游引物：5’-ACTTTGTAGGGTCGGTTCTG3’下游引物：5’-CCTAATGCCCAGTAGAGAGC-3’，PCR產(chǎn)物344 bp。內(nèi)參照GAPDH引物序列：上游引物：5’-CTTCACCACCATGGAGAAGGC-3’,下游引物：5’-GGCATGGACTGTGGTCATGAG-3’，PCR產(chǎn)物237 bp。MMP9引物濃度為10 pmol/μl,內(nèi)參照GAPDH引物濃度為50 pmol/μl。

反應(yīng)總體系為20 μl,5×PCR Buffer 5 μl,TaKaRa Ex TaqTMHS 0.125 μl,上游特異性PCR引物1.0 μl,下游特異性PCR引物1.0 μl,內(nèi)參照GAPDH上游引物0.2 μl,內(nèi)參照下游引物0.2 μl，cDNA 2 μl,加滅菌超純水至20 μl。MMP-9擴(kuò)增程序：94℃ 2 min 1次，94℃ 30 s，55.5℃ 30 s，72℃ 1 min，30循環(huán)；72℃ 5 min終末延伸。

PCR產(chǎn)物分析：將PCR產(chǎn)物在1.8%瓊脂糖凝膠上電泳，樣品加樣量均為6 μl(PCR產(chǎn)物5 μl+loading buffer 1 μl),在0.5×TBE中100V電泳40 min，經(jīng)凝膠成象儀處理成像，將圖像輸入圖像分析軟件系統(tǒng)(Quantity One-4.4.0,BIO-RAD)，計(jì)算出PCR產(chǎn)物密度含量，用目的基因擴(kuò)增量與內(nèi)參照基因擴(kuò)增量的比值來表示所要檢測(cè)基因的相對(duì)表達(dá)量?；虻南鄬?duì)表達(dá)量=目的基因光密度值/內(nèi)參照基因光密度值×100%。

1.5 免疫組化技術(shù)檢測(cè)MMP-9蛋白水平的表達(dá) 冷凍傷后各相應(yīng)時(shí)相點(diǎn)大鼠經(jīng)1%戊巴比妥鈉(60 mg/kg)深麻醉，剪開胸前臂，暴露心臟，經(jīng)左室插入靜脈針頭直達(dá)主動(dòng)脈，快速灌注肝素生理鹽水，剪開右心耳放血，待流出液體清亮后(約需0.9%氯化鈉溶液200 ml)，再以4%多聚甲醛溶液灌注45 min，約300 ml固定。迅即斷頭取腦，以凍傷灶為中心切取冠狀腦組織塊，4%多聚甲醛溶液4℃固定24 h,常規(guī)石蠟包埋。使用時(shí)將石蠟包埋的腦組織連續(xù)冠狀切片(厚5 μm)，隔5取1，參照SABC試劑盒說明行MMP-9免疫組化檢測(cè)。陰性對(duì)照片用PBS代替一抗，陽(yáng)性對(duì)照用試劑盒內(nèi)附陽(yáng)性對(duì)照片。

鏡下觀察胞漿有棕黃色顆粒者為陽(yáng)性細(xì)胞。采用醫(yī)學(xué)圖像分析軟件(Leica Qwin，德國(guó))，進(jìn)行分析。每組隨機(jī)選擇6張免疫組化染色片(免疫組化染色強(qiáng)度大致一致)，每張切片隨機(jī)選取6個(gè)高倍視野，用圖像分析軟件對(duì)染色結(jié)果進(jìn)行灰度分析，以平均灰度值代表蛋白表達(dá)水平：蛋白表達(dá)強(qiáng)則灰度值低，反之則高。

2 結(jié)果

2.1 腦組織含水量的測(cè)定結(jié)果 在傷后2、6、24 h，傷后0.9%氯化鈉溶液治療組傷側(cè)腦組織含水量均高于假手術(shù)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，24 h最高；在傷后6、24 h，傷后異丙酚治療組腦組織含水量與傷后0.9氯化鈉溶液治療組比較均顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或<0.01)。見表1。

表1腦組織含水量

組別腦組織含水量假手術(shù)組78.06±0.53傷后0.9%氯化鈉溶液治療組 2h79.04±0.58# 6h80.12±0.71# 24h81.19±0.90#傷后異丙酚治療組 2h78.79±0.53* 6h79.24±0.52#△ 24h80.05±0.82☆

注：與假手術(shù)組比較，*P<0.05,#P<0.01;與傷后0.9%氯化鈉溶液組比較，△P<0.05，☆P<0.01

2.2 腦組織MMP-9 mRNA的表達(dá) 經(jīng)紫外分光光度計(jì)測(cè)定提取的總RNAOD260 /OD280的值為1.7～2.0，說明提取的總RNA純度良好。利用選定的逆轉(zhuǎn)錄條件和設(shè)定的二對(duì)引物對(duì)49份標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，分別得到MMP-9 344 bp和GAPDH 237 bp的擴(kuò)增產(chǎn)物。內(nèi)參照GAPDH在237 bp處亮度均衡，在各反應(yīng)系中擴(kuò)增結(jié)果基本一致，證實(shí)PCR反應(yīng)基本真實(shí)地反應(yīng)了MMP-9mRNA在腦組織中的表達(dá)。

3組光密度的比值結(jié)果，假手術(shù)組腦組織MMP-9 mRNA水平表達(dá)很低，腦冷凍傷后2 h,0.9%氯化鈉溶液組MMP-9 mRNA 水平較假手術(shù)組明顯升高，6 h最高，24 h仍保持在較高水平(P<0.01)；在傷后6 h及24 h，傷后異丙酚治療組腦組織MMP-9 mRNA水平與0.9%氯化鈉溶液組比較均降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見表2、圖1。

表2傷側(cè)腦組織MMP-9mRNA表達(dá)

組別MMP-9假手術(shù)組0.28±0.04傷后0.9%氯化鈉溶液治療組 2h0.73±0.13* 6h0.99±0.09* 24h0.86±0.12*傷后異丙酚治療組 2h0.65±0.11* 6h0.80±0.15*# 24h0.64±0.09*#

注：與假手術(shù)組比較，*P<0.01;與傷后0.9%氯化鈉溶液組比較，#P<0.01

圖1 腦冷凍傷后3組MMP-9 mRNA表達(dá)情況

2.3 MMP-9蛋白表達(dá)結(jié)果 假手術(shù)組腦組織MMP-9蛋白未見明顯陽(yáng)性表達(dá)，腦冷凍傷后2 h,0.9%氯化鈉溶液組MMP-9蛋白陽(yáng)性表達(dá)水平(蛋白表達(dá)強(qiáng)則灰度值低，反之則高)較假手術(shù)組明顯升高，6 h最高，24 h仍保持在較高水平(P<0.01)；陽(yáng)性細(xì)胞的主要來源于凍傷灶周圍的神經(jīng)元、膠質(zhì)細(xì)胞、微血管內(nèi)皮細(xì)胞，凍傷中心區(qū)無表達(dá)。在傷后6 h及24 h，傷后異丙酚治療組腦組織MMP-9蛋白表達(dá)水平與0.9%氯化鈉溶液組比較均顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或0.01)。見表3、圖2～7。

表3傷側(cè)腦組織MMP-9蛋白表達(dá)灰度值

組別MMP-9灰度值假手術(shù)組243.93±4.65傷后0.9%氯化鈉溶液治療組 2h156.45±4.14* 6h145.04±4.04* 24h152.25±4.40*傷后異丙酚治療組 2h158.90±3.35* 6h151.77±5.09*# 24h158.85±2.83*△

注：與假手術(shù)組比較，*P<0.01;與傷后0.9%氯化鈉溶液組比較，#P<0.05，△P< 0.01

圖2 假手術(shù)組腦組織MMP-9(免疫組化×400) 圖3 腦冷凍傷后2 h 0.9%氯化鈉溶液組MMP-9(免疫組化×400)

3 討論

創(chuàng)傷性腦水腫是一種混合性腦水腫，其病理生理機(jī)制一直處于探索之中[6]。其中血腦屏障受損及血管源性腦水腫的發(fā)生機(jī)制更是備受關(guān)注。顱腦損傷時(shí),血腦屏障受損,使其在形態(tài)和功能兩方面都發(fā)生改變,通透性改變是血腦屏障功能障礙的最重要表現(xiàn)。血腦屏障破壞后血液中毒性物質(zhì)進(jìn)入腦內(nèi),離子平衡失調(diào)引起腦水腫,可導(dǎo)致顱內(nèi)壓升高引起腦疝,往往是病人死亡的主要原因。緊密連接的開放、小泡轉(zhuǎn)運(yùn)的增強(qiáng)、內(nèi)皮細(xì)胞的損傷、基底膜的破壞及星形神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的損傷都可引起B(yǎng)BB通透性增加，導(dǎo)致血管源性腦水腫。

圖4 腦冷凍傷后6 h傷后0.9%氯化鈉溶液組MMP-9(免疫組化×400) 圖5 腦冷凍傷后24 h傷后0.9%氯化鈉溶液組MMP-9(免疫組化×400)

圖6 腦冷凍傷后6 h傷后異丙酚治療組MMP-9(免疫組化×400) 圖7 腦冷凍傷后24 h傷后異丙酚治療組MMP-9(免疫組化×400)

近期，基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)在血管源性腦水腫的研究中受到廣泛關(guān)注。MMPs是一組降解細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的鋅依賴蛋白酶，其表達(dá)和活性的升高可引起B(yǎng)BB通透性增加。研究顯示MMPs主要是MMP-9在顱腦損傷后表達(dá)增高，參與BBB的破壞及繼發(fā)性腦損害[3，4]。在腦冷凍傷模型，使用基質(zhì)金屬蛋白酶非特異性抑制劑MMI270，可明顯減輕血腦屏障的通透性、腦水腫及繼發(fā)性損害[7]。在本實(shí)驗(yàn)中，我們應(yīng)用RT-PCR技術(shù)從基因水平考察MMP-9的表達(dá)，應(yīng)用免疫組化從蛋白水平考察MMP-9的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,腦冷凍傷后2 h腦組織MMP-9表達(dá)顯著升高，24 h仍保持在較高水平。與Morita-Fujimura等[8]應(yīng)用酶譜法測(cè)定了小鼠冷凍傷模型MMP-9蛋白的表達(dá)情況相似。MMP-9陽(yáng)性表達(dá)主要見于凍傷灶周圍神經(jīng)元、膠質(zhì)細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等，凍傷中心壞死區(qū)無表達(dá)。與文獻(xiàn)報(bào)道關(guān)于MMP-9陽(yáng)性細(xì)胞分布[9]基本一致，說明凍傷灶周圍殘存的神經(jīng)元、膠質(zhì)細(xì)胞等被激活，表達(dá)并分泌MMP-9，介導(dǎo)血腦屏障基底膜及神經(jīng)組織的損傷。至于腦凍傷后涉及MMP-9活性表達(dá)的機(jī)制還不清楚。Morita-Fujimura等[8]研究顯示冷凍傷后活性氧的生成可促使MMP-9誘導(dǎo)并激活，進(jìn)而加重內(nèi)皮細(xì)胞的損傷和血管源性腦水腫的發(fā)展。應(yīng)用SOD1轉(zhuǎn)基因技術(shù)或基因敲除技術(shù)在其他的腦損傷模型也證實(shí)了活性氧可誘導(dǎo)并激活MMP-9，進(jìn)而破壞BBB。由此可見，活性氧自由基不僅直接損害內(nèi)皮細(xì)胞，還可以通過誘導(dǎo)并激活MMP-9，降解ECM，致使BBB完整性被破壞。MMP-9基因啟動(dòng)子區(qū)具有AP-1(激動(dòng)劑激活蛋白)的結(jié)合位點(diǎn)，腦冷凍傷時(shí)AP-1結(jié)合活性的增高可誘導(dǎo)MMP-9的表達(dá)，某些及早基因c-fos和c-jun可作用于AP-1結(jié)合位點(diǎn)。腦損傷后活性氧生成誘導(dǎo)了c-fos和c-jun的表達(dá)，后者激活了MMP-9的AP-1區(qū)，致使MMP-9表達(dá)增加。結(jié)合以往的資料，我們認(rèn)為腦冷凍傷后MMP-9的誘導(dǎo)及激活是BBB損壞、血管源性腦水腫形成發(fā)展的重要機(jī)制之一。

在傷后6 h及24 h，傷后異丙酚治療組腦組織MMP-9 mRNA及蛋白表達(dá)水平與0.9%氯化鈉溶液組比較均顯著降低。提示異丙酚具有抑制MMP-9基因表達(dá)的作用。而且與對(duì)腦水的影響基本平行，說明異丙酚可能通過抑制MMP-9基因表達(dá)來發(fā)揮對(duì)腦損傷后BBB的保護(hù)作用，減輕創(chuàng)傷后腦水腫。研究表明，異丙酚可抑制癌癥患者M(jìn)MP-9的表達(dá)[10]，可抑制腦缺血再灌注時(shí)腦組織MMP-9的表達(dá)上調(diào)來發(fā)揮腦保護(hù)作用[2]。在腦損傷時(shí)，增高的ROS可誘導(dǎo)MMP-9的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)，異丙酚具有抗過氧化損傷的作用[11]，異丙酚可能通過清除ROS 來介導(dǎo)對(duì)MMP-9的抑制作用。但具體的機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。

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2 紀(jì)風(fēng)濤，蓸銘輝，梁建軍，等.異丙酚預(yù)先給藥對(duì)大鼠局灶性腦缺血再灌注時(shí)腦組織p-JNK、MMP-9和AQP-4表達(dá)的影響.中華麻醉學(xué)雜志，2010，30：1357-1360.

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EffectofpropofolonneuronalMMP-9expressionafterbraininjuryinrats

SUNZhengqing,GAIChenglin,SUFang,etal.DepartmentofAnesthesiology,No.230HospitalofPLA,Heilongjiang,Dandong118000,China

ObjectiveTo observe the effect of propofol on neuronal MMP-9 expression after brain injury in rats and to explore its action mechanisms in neuroprotective effects.MethodsNinety-one health male Wistar rats were randomly divided into sham-operation group,saline group(saline treatment after brain injury),propofol group(propofol treatment after brain injury).Propofol dose was clinical anesthesia relevant dose(100mg/kg),which was injected intraperitoneally 15 min after brain frostbite,once every 2 hours.The brain frostbite models were established by skull external intelligence frostbite method,then the brain tissues were collected at 2,6,24 hours after frostbite.The brain water content was detected by dry wet weight method;the expression levels of MMP-9 mRNA were detected by RT-PCR;expression levels of MMP-9 protein were detected by immunohistochemistry.ResultsThe brain water content in saline group in different time points was significantly higher than that in sham-operation group(P<0.01),which peaked at 24 hours after brain frostbite.The brain water content in propofol group was significantly lower than that in saline group at 6,24 hours after brain frostbite(P<0.05 orP<0.01).The expression levels of MMP-9 mRNA in sham-operation group were decreased,however,which in saline group were significantly increased at 2 hours after brain frostbite,as compared with those in sham-operation(P<0.01),which peaked at 6 hours,continued at 24 hours(P<0.01).The expression levels of MMP-9 mRNA in propofol group were significantly decreased at 6,24 hours after brain frostbite,as compared with those in saline group(P<0.05 orP<0.01).The expression levels of MMP-9 protein in saline group were significantly increased at 2 hours after brain frostbite,as compared with those in sham-operation group,which peaked at 6 hours,continued at 24 hours(P<0.01).The expression levels of MMP-9 protein in propofol group were significantly decreased at 6h,24h after brain frostbite,as compared with those in saline group(P<0.05 orP<0.01).ConclusionPropofol at clinical anesthesia relevant dose can relieve brain edema after brain injury,which may be correlated to the inhibitory effect of propofol on expression of MMP-9.

propofol;traumatic brain injury;MMP-9;brain edema

10.3969/j.issn.1002-7386.2014.16.001

118000 遼寧省丹東市，中國(guó)人民解放軍第230醫(yī)院麻醉科(孫正清、蓋成林、蘇芳)；第三軍醫(yī)大學(xué)附屬新橋醫(yī)院麻醉科(楊天德)

楊天德，400038 第三軍醫(yī)大學(xué)附屬新橋醫(yī)院麻醉科;

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R 614

A

1002-7386(2014)16-2405-05

2014-04-02)