吳艷　黃力彥　譚艷來(lái)等

摘要：用高效液相色譜法建立馬拉硫磷手性農(nóng)藥對(duì)映異構(gòu)體的拆分檢測(cè)方法，以大鼠為研究對(duì)象，分為空白對(duì)照組（C）和試驗(yàn)組（T）。C組灌胃生理鹽水2 mL/只，試驗(yàn)組灌胃馬拉硫磷700 mg/kg后，分15、30、60、120 min分別采大鼠血漿、心臟、肝臟等樣品，測(cè)定所有試驗(yàn)鼠血漿、組織中馬拉硫磷對(duì)映體含量的變化情況，用EF（對(duì)映體分?jǐn)?shù)）表示。通過(guò)口服途徑對(duì)大鼠進(jìn)行馬拉硫磷對(duì)映體分析方法的建立及選擇性代謝行為研究。結(jié)果表明，馬拉硫磷對(duì)映體在大鼠血漿和組織中代謝存在明顯的立體選擇性，且R-構(gòu)型較S-構(gòu)型活性高。

關(guān)鍵詞：馬拉硫磷；大鼠；對(duì)映體分?jǐn)?shù)

中圖分類號(hào)： O657.7+2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：1002-1302（2014）07-0306-03

收稿日期：2013-11-27

基金項(xiàng)目：廣東省科技計(jì)劃（編號(hào)：2011B040300015）。

作者簡(jiǎn)介：吳艷（1983—），女，安徽蚌埠人，碩士研究生，工程師，主要從事化學(xué)分析，色譜分析等方面的研究。E-mail：gyswuyan@163.com。有機(jī)磷手性農(nóng)藥被作為殺蟲劑和殺菌劑廣泛應(yīng)用，對(duì)映異構(gòu)體具有幾乎完全相同的物理化學(xué)性質(zhì)，但是其生物活性、毒性、代謝、殘留等行為差別較大。但由于手性農(nóng)藥的特殊性，對(duì)映體選擇性的轉(zhuǎn)化及代謝行為還是人們比較陌生的領(lǐng)域，因此對(duì)映體的檢測(cè)和代謝行為引起了人們廣泛的關(guān)注。

馬拉硫磷是目前廣泛使用的手性農(nóng)藥，具有多種毒性效應(yīng)，包括神經(jīng)毒性、遺傳毒性、免疫毒性和生殖毒性[1-2]等。目前對(duì)于馬拉硫磷的水解，以及在土壤中的降解等行為已經(jīng)研究得較為清楚，有關(guān)毒性、毒理方面的研究也已有很多報(bào)道。對(duì)于以高效液相色譜法建立馬拉硫磷手性農(nóng)藥對(duì)映異構(gòu)體的殘留檢測(cè)方法，通過(guò)測(cè)定血樣及組織中對(duì)映體含量的變化情況，最終確定對(duì)映體的選擇性代謝行為。本研究探討了農(nóng)藥對(duì)人類健康潛在危害的成因，為合理使用農(nóng)藥、制定相關(guān)食品安全法規(guī)提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1主要儀器和藥劑

安捷倫-1100型高效液相色譜儀，配有四元泵；RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀；馬拉硫磷標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液濃度為100 mg/L，由農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測(cè)所提供。無(wú)水硫酸鈉（分析純），乙酸乙酯、乙腈（美國(guó)天地）、異丙醇及正己烷為色譜純；用前過(guò)0.45 μm濾膜，去離子三蒸水。

1.2馬拉硫磷手性拆分與定量

手性拆分由高效液相色譜儀完成，每次分離進(jìn)樣量 10 μL，手性色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）為纖維素三苯甲酸酯（CDMPC，由本實(shí)驗(yàn)室自制）[3-4]，流動(dòng)相為正己烷 ∶異丙醇=95 ∶5（體積比），流速0.8 mL/min，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm，檢測(cè)器進(jìn)行定量分析。以保留時(shí)間定性，峰面積外標(biāo)法定量[5-6]。柱溫15 ℃，配制濃度為0.30、1.65、3.03、1510、30.30、151.00 μmol/L 的馬拉硫磷標(biāo)準(zhǔn)溶液，以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，得出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合計(jì)算出馬拉硫磷對(duì)映體的濃度。采用峰高定量，高效液相色譜測(cè)試稀釋的標(biāo)準(zhǔn)樣品，以噪聲的3倍計(jì)算出農(nóng)藥的最小檢測(cè)靈敏度。

1.3動(dòng)物試驗(yàn)和分組

1.3.1試驗(yàn)動(dòng)物及分組35只清潔級(jí)雄性 SD大鼠，體重 200 g左右，購(gòu)于廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。飼養(yǎng)環(huán)境溫度（20.0±1.0）℃，濕度 50%～60%，自由飲水進(jìn)食。35只大鼠預(yù)飼1周后，分為空白對(duì)照組（C），C組灌胃生理鹽水 2 mL/只；試驗(yàn)組共分4組，每組7只大鼠。試驗(yàn)組灌胃馬拉硫磷700 mg/kg后，（1）T1：處理后15 min；（2）T2：處理后 30 min；（3）T3：處理后60 min；（4）T4：處理后120 min；采大鼠血漿、心臟、肝臟等，-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2樣品處理移取5 mL血漿于50 mL聚丙烯離心管中，加入30 mL乙腈-正己烷（1 ∶1）溶液，渦旋振蕩提取 30 min，6 000 r/min，離心5 min，上清液轉(zhuǎn)入250 mL分液漏斗中，另用30 mL乙腈-正己烷（1 ∶1）提取殘留物，合并提取液。用40 mL正己烷與40 mL飽和NaCl溶液萃取。靜置分層后，收集正己烷層（無(wú)水硫酸鈉干燥），旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至 4 mL，再用乙腈提取3次，棄去正己烷層，并收集乙腈層，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀干燥后0.5 mL正己烷定容，過(guò)0.45 μm濾膜后取20 μL進(jìn)樣。組織樣品勻漿后，稱取5 g樣品勻漿液于50 mL聚丙烯離心管中，后續(xù)處理方法同上血漿前處理方法。

1.4統(tǒng)計(jì)處理

采用對(duì)映體分?jǐn)?shù)EF值作為馬拉硫磷手性對(duì)映體選擇性變化的指標(biāo)[7]，EF=E1/（E1+E2）。E1和E2分別表示第1個(gè)出峰的對(duì)映體與第2個(gè)出峰的對(duì)映體的峰面積。EF值的變化范圍在0～1.0之間，EF=0.5表示外消旋體。所得到的EF值偏離外消旋體標(biāo)樣的EF值越遠(yuǎn)，表明馬拉硫磷對(duì)映體在樣本中的立體選擇性行為越明顯。本研究中E1代表R-構(gòu)型，E2代表S-構(gòu)型。

2結(jié)果與分析

2.1馬拉硫磷的HPLC色譜分析

馬拉硫磷經(jīng)自制纖維素三苯甲酸酯（CDMPC）手性固定相色譜柱，8 min內(nèi)分離成2個(gè)峰，經(jīng)圓二色檢測(cè)器[8-9]，確定2個(gè)對(duì)映體流出先后順序?yàn)橄攘鞒龅氖怯倚?，后流出的是左旋。?.3～151.0 μmol/L的范圍內(nèi)，2個(gè)對(duì)映體峰面積與濃度呈線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.999 3、0.999 6。最低檢測(cè)限為 81.2 nmol/L，檢測(cè)靈敏度高。配制15.1 μmol/L的馬拉硫磷測(cè)定的右旋、左旋對(duì)映體的日內(nèi)、日間精密度分別為337%、521%和4.24%、5.53%，均在6%以內(nèi)，精密度符合要求，測(cè)定方法可靠，可以作為定量的依據(jù)，結(jié)果見(jiàn)表1。馬拉硫磷在大鼠血漿、心臟和肝臟等組織中的回收率分別為7375%～119.95%，結(jié)果見(jiàn)表2。endprint

3討論

一般認(rèn)為，有機(jī)磷農(nóng)藥中毒主要機(jī)理是抑制乙酰膽堿酯酶的活性，引起中樞神經(jīng)調(diào)節(jié)功能紊亂、神經(jīng)過(guò)分刺激、沖動(dòng)不能休止，造成機(jī)體痙攣、癱瘓等一系列神經(jīng)中毒癥狀，甚至死亡。

手性化合物對(duì)映體在代謝過(guò)程中的立體選擇性表現(xiàn)在吸收、分布、代謝和消除的整個(gè)過(guò)程中，這種選擇性來(lái)源于手性藥物與生物體內(nèi)的手性環(huán)境及內(nèi)源性手性分子的相互作用。手性農(nóng)藥在體內(nèi)，可能受酶系統(tǒng)或消化道菌叢的作用發(fā)生結(jié)構(gòu)性生物轉(zhuǎn)化。

本研究中，經(jīng)口服灌胃外消旋馬拉硫磷后，在大鼠體內(nèi)表現(xiàn)出明顯的立體選擇性藥代動(dòng)力學(xué)行為和降解特征，用藥后1 h內(nèi)，2對(duì)映體在血漿中的濃度差異很大，EF值趨于1，表明S-構(gòu)型在代謝過(guò)程中消失。造成這種現(xiàn)象最有可能的原因就是對(duì)映體發(fā)生了轉(zhuǎn)化。在藥物進(jìn)入血液中后，由于某種酶的作用，馬拉硫磷左旋體發(fā)生轉(zhuǎn)化，迅速轉(zhuǎn)化成對(duì)映體右旋體，相關(guān)機(jī)理還有待于進(jìn)一步深入研究。

藥物代謝可以從體內(nèi)消除，也可進(jìn)一步代謝。大多數(shù)代謝在肝中進(jìn)行，也有在其他器官代謝。從各組織中EF含量可見(jiàn)，在心臟和肝臟組織中R-構(gòu)型的含量也是一直高于S-構(gòu)型的，隨時(shí)間的增加EF值趨于穩(wěn)定。由此可以推斷出馬拉硫磷的毒性與構(gòu)型相關(guān)，且R-構(gòu)型起主要作用。本結(jié)論也與一般認(rèn)為有機(jī)磷殺蟲活性與對(duì)動(dòng)物的毒性相關(guān)，R-構(gòu)型較S-構(gòu)型具有更高的活性的結(jié)論相符[11]。本研究結(jié)果馬拉硫磷對(duì)映體在大鼠血漿和組織中代謝存在明顯的立體選擇性，且R-構(gòu)型較S-構(gòu)型活性高，S-構(gòu)型不穩(wěn)定，易降解轉(zhuǎn)化。

參考文獻(xiàn)：

[1]Abdel R A，Dechkovska I M，Gold S B，et al. Neurological deficits induced by malathion，DEET，and permethrin，alone or in combination in adult rats[J]. Toxicol Environ Health A，2004，67：331-356.

[2]Betancourt M，Reséndiz A，F(xiàn)ierro E C R. Effect of two insecticides and two herbicides on the porcine sperm motility patterns using computer-assisted semen analysis（CASA） in vitro[J]. Reproductive Toxicology，2006，22：508-512.

[3]Huisdea R E，kraak J C，Poppe H. Modification of silica with glucose for the separation of proteins by high-performance liquid chromatography[J]. Journal of Chromatography a，1990，508（2）：289-299.

[4]孟磊，鄭先福，寧愛(ài)民，等. 纖維素-三（3，5-二甲基苯基氨基甲酸酯）手性柱的制備及應(yīng)用[J]. 河南科學(xué)，2005，23（3）：352-355.

[5]Uhe A M，Collier G R，Mclennan E A，et al. Quantitation of tryptophan and other plasma amino acids by automated pre-column O-phthaldialdehyde derivatization high-performance liquid chromatography：improved sample preparation[J]. J Chrom，1991，564：81-91.

[6]di Pierro D，Lazzarino G，Pastore F S，et al. Determination of boronophenylalanine in biological samples using precolumn O-phthalaldehyde derivatization and reversed-phase high-performance liquid chromatography[J]. Analytical Biochemistry，2000，284（2）：301-306.

[7]Ulrich E M，F(xiàn)oreman W T. Complications with using ratios for environmental data：Comparing enantiomeric ratios（ERs）and enantiomer fractions（EFs）[J]. Chemosphere，2003，53：531-538.

[8]Berkm A E，Qu Inn dA. Thompson C M.interaction of acetylcholine sterase with the enantiomers of malathion and Iso malathion[J]. Chemical Research in Toxicology，1993，6：724-730.

[9]王鵬，王玉紅，馮楠，等. 淀粉衍生物固定相對(duì)馬拉硫磷和氟蟲腈對(duì)映體的手性拆分[J]. 應(yīng)用化學(xué)，2006，23（10）：1170-1172.

[10]Shafer T J，Meyer D A，Crofton K M. Developmental neurotoxicity of pyrethroid insecitides：critical review and future research needs[J]. Environmental Health Perspectives，2005，113（2）：123-136.

[11]周炳，趙美蓉，張安平，等. 馬拉硫磷對(duì)映體對(duì)人成神經(jīng)細(xì)胞瘤細(xì)胞生長(zhǎng)影響的選擇性差異[J]. 農(nóng)藥學(xué)學(xué)報(bào)，2007，9（3）：263-268.endprint

3討論

一般認(rèn)為，有機(jī)磷農(nóng)藥中毒主要機(jī)理是抑制乙酰膽堿酯酶的活性，引起中樞神經(jīng)調(diào)節(jié)功能紊亂、神經(jīng)過(guò)分刺激、沖動(dòng)不能休止，造成機(jī)體痙攣、癱瘓等一系列神經(jīng)中毒癥狀，甚至死亡。

手性化合物對(duì)映體在代謝過(guò)程中的立體選擇性表現(xiàn)在吸收、分布、代謝和消除的整個(gè)過(guò)程中，這種選擇性來(lái)源于手性藥物與生物體內(nèi)的手性環(huán)境及內(nèi)源性手性分子的相互作用。手性農(nóng)藥在體內(nèi)，可能受酶系統(tǒng)或消化道菌叢的作用發(fā)生結(jié)構(gòu)性生物轉(zhuǎn)化。

本研究中，經(jīng)口服灌胃外消旋馬拉硫磷后，在大鼠體內(nèi)表現(xiàn)出明顯的立體選擇性藥代動(dòng)力學(xué)行為和降解特征，用藥后1 h內(nèi)，2對(duì)映體在血漿中的濃度差異很大，EF值趨于1，表明S-構(gòu)型在代謝過(guò)程中消失。造成這種現(xiàn)象最有可能的原因就是對(duì)映體發(fā)生了轉(zhuǎn)化。在藥物進(jìn)入血液中后，由于某種酶的作用，馬拉硫磷左旋體發(fā)生轉(zhuǎn)化，迅速轉(zhuǎn)化成對(duì)映體右旋體，相關(guān)機(jī)理還有待于進(jìn)一步深入研究。

藥物代謝可以從體內(nèi)消除，也可進(jìn)一步代謝。大多數(shù)代謝在肝中進(jìn)行，也有在其他器官代謝。從各組織中EF含量可見(jiàn)，在心臟和肝臟組織中R-構(gòu)型的含量也是一直高于S-構(gòu)型的，隨時(shí)間的增加EF值趨于穩(wěn)定。由此可以推斷出馬拉硫磷的毒性與構(gòu)型相關(guān)，且R-構(gòu)型起主要作用。本結(jié)論也與一般認(rèn)為有機(jī)磷殺蟲活性與對(duì)動(dòng)物的毒性相關(guān)，R-構(gòu)型較S-構(gòu)型具有更高的活性的結(jié)論相符[11]。本研究結(jié)果馬拉硫磷對(duì)映體在大鼠血漿和組織中代謝存在明顯的立體選擇性，且R-構(gòu)型較S-構(gòu)型活性高，S-構(gòu)型不穩(wěn)定，易降解轉(zhuǎn)化。

參考文獻(xiàn)：

[1]Abdel R A，Dechkovska I M，Gold S B，et al. Neurological deficits induced by malathion，DEET，and permethrin，alone or in combination in adult rats[J]. Toxicol Environ Health A，2004，67：331-356.

[2]Betancourt M，Reséndiz A，F(xiàn)ierro E C R. Effect of two insecticides and two herbicides on the porcine sperm motility patterns using computer-assisted semen analysis（CASA） in vitro[J]. Reproductive Toxicology，2006，22：508-512.

[3]Huisdea R E，kraak J C，Poppe H. Modification of silica with glucose for the separation of proteins by high-performance liquid chromatography[J]. Journal of Chromatography a，1990，508（2）：289-299.

[4]孟磊，鄭先福，寧愛(ài)民，等. 纖維素-三（3，5-二甲基苯基氨基甲酸酯）手性柱的制備及應(yīng)用[J]. 河南科學(xué)，2005，23（3）：352-355.

[5]Uhe A M，Collier G R，Mclennan E A，et al. Quantitation of tryptophan and other plasma amino acids by automated pre-column O-phthaldialdehyde derivatization high-performance liquid chromatography：improved sample preparation[J]. J Chrom，1991，564：81-91.

[6]di Pierro D，Lazzarino G，Pastore F S，et al. Determination of boronophenylalanine in biological samples using precolumn O-phthalaldehyde derivatization and reversed-phase high-performance liquid chromatography[J]. Analytical Biochemistry，2000，284（2）：301-306.

[7]Ulrich E M，F(xiàn)oreman W T. Complications with using ratios for environmental data：Comparing enantiomeric ratios（ERs）and enantiomer fractions（EFs）[J]. Chemosphere，2003，53：531-538.

[8]Berkm A E，Qu Inn dA. Thompson C M.interaction of acetylcholine sterase with the enantiomers of malathion and Iso malathion[J]. Chemical Research in Toxicology，1993，6：724-730.

[9]王鵬，王玉紅，馮楠，等. 淀粉衍生物固定相對(duì)馬拉硫磷和氟蟲腈對(duì)映體的手性拆分[J]. 應(yīng)用化學(xué)，2006，23（10）：1170-1172.

[10]Shafer T J，Meyer D A，Crofton K M. Developmental neurotoxicity of pyrethroid insecitides：critical review and future research needs[J]. Environmental Health Perspectives，2005，113（2）：123-136.

[11]周炳，趙美蓉，張安平，等. 馬拉硫磷對(duì)映體對(duì)人成神經(jīng)細(xì)胞瘤細(xì)胞生長(zhǎng)影響的選擇性差異[J]. 農(nóng)藥學(xué)學(xué)報(bào)，2007，9（3）：263-268.endprint

3討論

一般認(rèn)為，有機(jī)磷農(nóng)藥中毒主要機(jī)理是抑制乙酰膽堿酯酶的活性，引起中樞神經(jīng)調(diào)節(jié)功能紊亂、神經(jīng)過(guò)分刺激、沖動(dòng)不能休止，造成機(jī)體痙攣、癱瘓等一系列神經(jīng)中毒癥狀，甚至死亡。

手性化合物對(duì)映體在代謝過(guò)程中的立體選擇性表現(xiàn)在吸收、分布、代謝和消除的整個(gè)過(guò)程中，這種選擇性來(lái)源于手性藥物與生物體內(nèi)的手性環(huán)境及內(nèi)源性手性分子的相互作用。手性農(nóng)藥在體內(nèi)，可能受酶系統(tǒng)或消化道菌叢的作用發(fā)生結(jié)構(gòu)性生物轉(zhuǎn)化。

本研究中，經(jīng)口服灌胃外消旋馬拉硫磷后，在大鼠體內(nèi)表現(xiàn)出明顯的立體選擇性藥代動(dòng)力學(xué)行為和降解特征，用藥后1 h內(nèi)，2對(duì)映體在血漿中的濃度差異很大，EF值趨于1，表明S-構(gòu)型在代謝過(guò)程中消失。造成這種現(xiàn)象最有可能的原因就是對(duì)映體發(fā)生了轉(zhuǎn)化。在藥物進(jìn)入血液中后，由于某種酶的作用，馬拉硫磷左旋體發(fā)生轉(zhuǎn)化，迅速轉(zhuǎn)化成對(duì)映體右旋體，相關(guān)機(jī)理還有待于進(jìn)一步深入研究。

藥物代謝可以從體內(nèi)消除，也可進(jìn)一步代謝。大多數(shù)代謝在肝中進(jìn)行，也有在其他器官代謝。從各組織中EF含量可見(jiàn)，在心臟和肝臟組織中R-構(gòu)型的含量也是一直高于S-構(gòu)型的，隨時(shí)間的增加EF值趨于穩(wěn)定。由此可以推斷出馬拉硫磷的毒性與構(gòu)型相關(guān)，且R-構(gòu)型起主要作用。本結(jié)論也與一般認(rèn)為有機(jī)磷殺蟲活性與對(duì)動(dòng)物的毒性相關(guān)，R-構(gòu)型較S-構(gòu)型具有更高的活性的結(jié)論相符[11]。本研究結(jié)果馬拉硫磷對(duì)映體在大鼠血漿和組織中代謝存在明顯的立體選擇性，且R-構(gòu)型較S-構(gòu)型活性高，S-構(gòu)型不穩(wěn)定，易降解轉(zhuǎn)化。

參考文獻(xiàn)：

[1]Abdel R A，Dechkovska I M，Gold S B，et al. Neurological deficits induced by malathion，DEET，and permethrin，alone or in combination in adult rats[J]. Toxicol Environ Health A，2004，67：331-356.

[2]Betancourt M，Reséndiz A，F(xiàn)ierro E C R. Effect of two insecticides and two herbicides on the porcine sperm motility patterns using computer-assisted semen analysis（CASA） in vitro[J]. Reproductive Toxicology，2006，22：508-512.

[3]Huisdea R E，kraak J C，Poppe H. Modification of silica with glucose for the separation of proteins by high-performance liquid chromatography[J]. Journal of Chromatography a，1990，508（2）：289-299.

[4]孟磊，鄭先福，寧愛(ài)民，等. 纖維素-三（3，5-二甲基苯基氨基甲酸酯）手性柱的制備及應(yīng)用[J]. 河南科學(xué)，2005，23（3）：352-355.

[5]Uhe A M，Collier G R，Mclennan E A，et al. Quantitation of tryptophan and other plasma amino acids by automated pre-column O-phthaldialdehyde derivatization high-performance liquid chromatography：improved sample preparation[J]. J Chrom，1991，564：81-91.

[6]di Pierro D，Lazzarino G，Pastore F S，et al. Determination of boronophenylalanine in biological samples using precolumn O-phthalaldehyde derivatization and reversed-phase high-performance liquid chromatography[J]. Analytical Biochemistry，2000，284（2）：301-306.

[7]Ulrich E M，F(xiàn)oreman W T. Complications with using ratios for environmental data：Comparing enantiomeric ratios（ERs）and enantiomer fractions（EFs）[J]. Chemosphere，2003，53：531-538.

[8]Berkm A E，Qu Inn dA. Thompson C M.interaction of acetylcholine sterase with the enantiomers of malathion and Iso malathion[J]. Chemical Research in Toxicology，1993，6：724-730.

[9]王鵬，王玉紅，馮楠，等. 淀粉衍生物固定相對(duì)馬拉硫磷和氟蟲腈對(duì)映體的手性拆分[J]. 應(yīng)用化學(xué)，2006，23（10）：1170-1172.

[10]Shafer T J，Meyer D A，Crofton K M. Developmental neurotoxicity of pyrethroid insecitides：critical review and future research needs[J]. Environmental Health Perspectives，2005，113（2）：123-136.

[11]周炳，趙美蓉，張安平，等. 馬拉硫磷對(duì)映體對(duì)人成神經(jīng)細(xì)胞瘤細(xì)胞生長(zhǎng)影響的選擇性差異[J]. 農(nóng)藥學(xué)學(xué)報(bào)，2007，9（3）：263-268.endprint