何 芳 朱 艷

·論著·

孕激素介導(dǎo)uPA在卵巢癌治療中的相關(guān)研究

何 芳 朱 艷

目的 探討孕激素介導(dǎo)uPA治療卵巢癌的可能機(jī)制。方法 傳代培養(yǎng)人卵巢癌細(xì)胞HO-8910, 應(yīng)用Western blot方法檢測(cè)對(duì)照組(未加孕激素組)和加入含有不同濃度孕激素培養(yǎng)液處理組, 作用72 h后對(duì)人卵巢癌細(xì)胞HO-8910 uPA表達(dá)的影響。結(jié)果 Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明孕激素能夠抑制uPA的表達(dá), 呈濃度依賴(lài)性。結(jié)論 孕激素對(duì)卵巢癌細(xì)胞有抑制作用并且抑制人卵巢癌細(xì)胞uPA的表達(dá), 提示孕激素用于卵巢癌的輔助治療可能介導(dǎo)對(duì)uPA的影響起作用。

尿激酶型纖溶蛋白酶原激活劑；卵巢癌；孕激素；蛋白印記法

尿激酶型纖溶蛋白酶原激活系統(tǒng)(uPA系統(tǒng))主要包括尿激酶型纖溶酶原激活物(uPA)﹑uPA特異性受體(uPAR)和纖溶酶原激活物抑制物-1(PAI-1)。uPA能激活無(wú)活性纖維蛋白溶解酶原生成纖溶酶, 使纖維蛋白水解成可溶性肽類(lèi)片段。纖維蛋白溶解參與腫瘤生長(zhǎng)和腫瘤細(xì)胞的浸入過(guò)程, uPA調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的降解, 并能激活刺激腫瘤生長(zhǎng)因子和其他蛋白酶［1］。腫瘤自身分泌的uPA可激活纖溶酶原為纖溶酶, 使基底膜裂開(kāi), 有利于腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移［2］。

有學(xué)者認(rèn)為：孕激素抑制癌細(xì)胞是孕激素作用于癌細(xì)胞并與孕激素受體結(jié)合形成復(fù)合物進(jìn)入細(xì)胞核, 延緩DNA和RNA復(fù)制, 抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)［3］。但其確切機(jī)制, 仍不清楚。對(duì)于uPA在卵巢癌中的抗原表達(dá)及含量國(guó)外已有報(bào)道, 關(guān)于孕激素應(yīng)用于卵巢癌的輔助治療也有報(bào)道。但關(guān)于孕激素對(duì)卵巢癌細(xì)胞中uPA表達(dá)的影響目前尚無(wú)報(bào)道。本研究旨在應(yīng)用 Western-blot法研究孕激素對(duì)人卵巢癌細(xì)胞中uPA表達(dá)的影響, 從而探討孕激素在卵巢癌輔助治療中的可能機(jī)制,為臨床治療卵巢癌提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞來(lái)源 卵巢漿液性囊腺癌細(xì)胞HO-8910(上海中科院細(xì)胞庫(kù))細(xì)胞形態(tài)及生物學(xué)特征均符合卵巢漿液性囊腺癌特征。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

RPMI-1640培養(yǎng)液(大連晨玉)

胰酶 (大連晨玉)

Hepes(大連晨玉)

標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清(大連博瑞德)

MTT(大連博瑞德)

uPA兔抗人多克隆抗體(北京博士德)

SP免疫試劑盒(北京中杉)

二甲基亞砜(大連誠(chéng)銳)

蛋白印記試劑如：NC﹑丙烯酰胺﹑甲基雙丙烯酰胺﹑Tris﹑甘氨酸﹑氯化鈉﹑甲醇﹑冰乙酸﹑脫脂奶粉等(大連博瑞德)

耗材(沈聯(lián)化學(xué)試劑玻璃儀器有限公司)

1.1.3 主要設(shè)備

相差倒置顯微鏡(olympus公司)

CO2孵箱(Forma公司)

常溫臺(tái)式離心機(jī)(Sigma公司)

超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)(寧波新芝生物科技股份有限公司)

三用水箱(北京醫(yī)療設(shè)備廠)

多用途水浴恒溫振蕩器(江蘇太倉(cāng)市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠)

電泳儀(大連捷邁生物公司)

轉(zhuǎn)膜儀(大連捷邁生物公司)

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) ①試劑配置：RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)基：用于培養(yǎng)卵巢癌細(xì)胞HO-8910。每升培養(yǎng)液中含RPMI 1640粉劑10.4 g﹑HEPES 4.8 g﹑NaHCO32.0 g﹑經(jīng)滅活的胎牛血清(FCS)100 ml﹑青霉素及鏈霉素各100 U/ml, 調(diào)節(jié)pH=7.4,抽濾滅菌, 分裝, 4 ℃保存。PBS (10×)：稱(chēng)取NaCl 8.5 g, Kcl 0.2 g, Na2HPO4·12H2O 2.85 g, KH2PO40.24 g, ddH2O 100 ml, 調(diào)pH=7.4, 高壓滅菌, 保存于4℃。②細(xì)胞培養(yǎng)：人卵巢癌細(xì)胞HO-8910常規(guī)培養(yǎng)于含10%胎牛血清﹑雙抗的RPMI-1640完全培養(yǎng)基中。置37℃﹑5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng), 相對(duì)濕度90%, 培養(yǎng)至70%～80%融合時(shí), 0.25%胰蛋白酶消化﹑傳代。當(dāng)細(xì)胞達(dá)到一定數(shù)量后, 細(xì)胞記數(shù), 將一定數(shù)量細(xì)胞分別培養(yǎng)在4個(gè)大培養(yǎng)瓶中, 第2天待細(xì)胞貼壁后置入4℃恒溫箱1 h,促成細(xì)胞同步化生長(zhǎng), 然后加入等量的含不同濃度孕激素的培養(yǎng)液, 繼續(xù)培養(yǎng)72 h。作用72 h后將4個(gè)培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞消化下來(lái)離心收集, 保存在-70℃冰箱中備用。

1.2.2 MTT比色法 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人卵巢癌細(xì)胞HO-8910, 5×10-3/孔細(xì)胞數(shù)接種于96孔板, 置37℃﹑5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng), 第2天大部分貼壁后置入4℃恒溫箱1 h, 促成細(xì)胞同步化生長(zhǎng), 棄上清, 然后加入含有從1×10-4mol/L倍比稀釋至0.03125×10-4mol/L(由于孕激素是用酒精溶解為避免酒精對(duì)卵巢癌細(xì)胞有抑制作用故選取的酒精濃度＜1%)孕激素的等量培養(yǎng)液中, 并設(shè)陰性對(duì)照(不加孕激素組)﹑空白對(duì)照(不加細(xì)胞組)及1%酒精組, 共8組, 每組設(shè)4個(gè)副孔,培養(yǎng)48 h﹑72 h后, 各孔加入20 μlMTT溶液(濃度5 g/l), 輕輕震蕩培養(yǎng)板, 繼續(xù)孵育4 h, 輕輕吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液, 每孔加入DMSO溶液150 μl, 輕輕震蕩15 min, 測(cè)A-580值。重復(fù)3次。篩選出合適的作用時(shí)間和孕激素濃度進(jìn)行Western blot實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 Western blot法 ①提蛋白：收集用含有終濃度為0.5×10-5﹑1×10-5﹑0.5×10-4mol/L孕激素培養(yǎng)液處理72 h后的人卵巢癌細(xì)胞HO-8910, 離心2500 rmp, 10 min;棄上清,用2 mlPBS吹吸洗滌細(xì)胞沉淀, 離心2500 rpm, 10 min;棄去上清, 用1 mlPBS吹吸洗滌細(xì)胞沉淀, 轉(zhuǎn)入1.5 mlEP管, 棄凈上清, 加入細(xì)胞裂解液, 超聲震蕩器震蕩, 4℃離心3000 rpm, 5 min, 提取上清, 取上清保存-20℃。②測(cè)蛋白：用754法測(cè)定蛋白含量, 計(jì)算上樣量。③配膠：將配制好的12% SDS-PAGE分離膠溶液5 ml混勻后立即將其注入邊條厚度為1.5 mm凝膠玻璃板內(nèi), 至梳齒下約1 cm, 表面加100 μl無(wú)水乙醇封住15 min后膠凝固將無(wú)水乙醇倒掉, 用蒸餾水清洗, 濾紙吸干。見(jiàn)表1。配制5%濃縮膠3 ml將其灌滿(mǎn), 立即傾斜插入梳子, 凝固1 h, 用蒸餾水沖洗, 加入TBE。見(jiàn)表2。④上樣：每孔上樣量為30 μl, 將蛋白質(zhì)樣品與樣品緩沖液在小EP管中混勻, 100℃加熱3 min, 離心1 s, 用微量注射器將樣品加入樣品孔中, 進(jìn)行電泳。其中一孔加入蛋白質(zhì)分子量Marker。⑤電泳：插好電極, 當(dāng)染料的前沿遷移至凝膠的底部約需2 h。電泳結(jié)束后, 關(guān)閉電源, 從電極上拔掉電極插頭, 將凝膠玻璃板從電泳槽中取出, 小心移動(dòng)兩玻璃板之間的隔片, 輕輕撬開(kāi)玻板, 使凝膠貼在其中的一塊板上。⑥轉(zhuǎn)膜及染色：電泳后將凝膠浸入轉(zhuǎn)移緩沖液1 h, 濾紙和硝酸纖維素膜剪成與凝膠同樣大小, 于轉(zhuǎn)移緩沖液中浸泡30 min, 按順序?qū)⑾跛崂w維素膜﹑凝膠﹑濾紙放好, 用玻璃棒將各層之間的空氣趕走進(jìn)行轉(zhuǎn)膜1 h, 轉(zhuǎn)移后將硝酸纖維素膜和凝膠麗春紅染色, 觀察條帶。⑦封閉及雜交 硝酸纖維素膜TBS漂洗﹑加脫脂奶粉封阻過(guò)夜﹑加一抗37℃1 h﹑TBS漂洗3次﹑加二抗37℃1 h﹑TBS漂洗3次﹑加酶標(biāo)37℃1 h﹑TBS漂洗3次。⑧顯色：取DAB顯色試劑, 在暗室內(nèi)與硝酸纖維素膜搖動(dòng)孵育1 min, 顯色, 數(shù)碼照相。經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)分析。

表1 12%的分離膠

表2 5%濃縮膠

2 結(jié)果

正常對(duì)照組和孕激素處理組卵巢癌細(xì)胞HO-8910中uPA的表達(dá)量, 見(jiàn)圖1。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果, 孕激素能夠抑制卵巢癌細(xì)胞HO-8910 uPA的表達(dá), 并且呈濃度依賴(lài)性。

經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)分析結(jié)果如圖2。

圖1 不同濃度孕激素對(duì)卵巢癌細(xì)胞uPA表達(dá)的影響

圖2 經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)分析

3 討論

卵巢癌是婦科常見(jiàn)的惡性腫瘤之一, 死亡率很高。手術(shù)與化療是治療卵巢癌的主要手段, 激素療法僅用于卵巢癌的輔助治療或?qū)熌退幉±墓孟⑿灾委?。由于激素療法的副反?yīng)小, 毒性低, 且有一定的療效, 因而越來(lái)越受到臨床的關(guān)注［4］。

本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用MTT比色法發(fā)現(xiàn)孕激素對(duì)人卵巢癌細(xì)胞HO-8910有抑制作用, 作用72 h后對(duì)人卵巢癌細(xì)胞HO-8910有明顯的抑制作用。近年來(lái)許多研究提示孕激素可降低卵巢癌的危險(xiǎn)性, 卵巢癌血清孕激素水平高者, 生存率提高［5］。陳曉軍等［6］以已行瘤體減滅術(shù)的卵巢癌患者1～4期為研究對(duì)象, 分為單純化療組﹑己酸孕酮組和普維拉組。隨訪﹑統(tǒng)計(jì)各組各期患者的生存率及復(fù)發(fā)率﹑血清激素水平﹑骨密度變化及化療反應(yīng), 結(jié)果顯示孕激素聯(lián)合以鉑類(lèi)為主的常規(guī)化療可以改善晚期卵巢癌的預(yù)后, 并且不增加化療的毒副作用, 可改善患者的骨量丟失。通過(guò)MTT比色法篩選出對(duì)卵巢癌細(xì)胞的抑制作用較明顯的合適濃度進(jìn)行Western blot實(shí)驗(yàn), 檢測(cè)孕激素對(duì)uPA的影響, 結(jié)果發(fā)現(xiàn),孕激素的濃度越大, uPA的表達(dá)越弱, 通過(guò)條帶分析發(fā)現(xiàn)含量也越少, 說(shuō)明孕激素能夠抑制uPA的表達(dá)。但孕激素做為卵巢癌治療的輔助藥物, 其作用機(jī)制不很清楚。檢測(cè)孕激素對(duì)uPA表達(dá)的抑制, 也許正是孕激素抑制卵巢癌細(xì)胞生長(zhǎng)的一條重要途徑, 可能是孕激素介導(dǎo)對(duì)uPA的表達(dá)而發(fā)揮治療作用。由于本實(shí)驗(yàn)選取的人卵巢癌細(xì)胞為漿液性囊腺癌細(xì)胞, 存在局限性, 不能說(shuō)明對(duì)所有卵巢癌病理分型都有作用, 還有待于進(jìn)一步的研究。并且在基因水平上還需要進(jìn)一步研究, 探討孕激素對(duì)uPA mRNA的影響及其可能機(jī)制。用激素替代治療為卵巢癌患者提供了新的非手術(shù)的輔助治療方法, 但是關(guān)于激素治療卵巢癌對(duì)人體是否會(huì)產(chǎn)生副作用目前還存在很大爭(zhēng)議, 有必要進(jìn)行臨床跟蹤隨訪。以u(píng)PA為靶點(diǎn)開(kāi)發(fā)出更多治療卵巢癌的導(dǎo)向藥物, 將成為新的研究熱點(diǎn)。

孕激素對(duì)卵巢癌細(xì)胞有抑制作用并且抑制人卵巢癌細(xì)胞uPA的表達(dá), 提示孕激素用于卵巢癌的輔助治療可能介導(dǎo)對(duì)uPA的影響起作用。本實(shí)驗(yàn)選取的人卵巢癌細(xì)胞為漿液性囊腺癌細(xì)胞, 存在局限性, 不能說(shuō)明對(duì)所有卵巢癌病理分型都有作用, 還有待于進(jìn)一步的研究。并且在基因水平上還需要進(jìn)一步研究, 探討孕激素對(duì)uPA mRNA的影響及其可能機(jī)制。用激素替代治療為卵巢癌患者提供了新的非手術(shù)的輔助治療方法, 但是關(guān)于激素治療卵巢癌對(duì)人體是否會(huì)產(chǎn)生副作用目前還存在很大爭(zhēng)議, 有必要進(jìn)行臨床跟蹤隨訪。

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Study about progestogen mediating uPA in ovary cancer treatment

HE Fang, ZHU Yan

Shenyang Womenand Infats Hospital, Shenyang 110000, China

Objective To discuss the possible mechanism of treating ovary cancer by progestogen mediating uPA Methods Serial subcultivated human ovary cancr cell HO-8910 and then two groups were divided, the control group(no progestogen added) and the group of progestogen culture fluid of different concentration added.After effection of 72 hours , western blot was used to detect the different expression of uPA in human ovary cell HO-8910 in the two groups.Results The results of western blot indicated that progestogen might inhibit the expression of uPA and to be present concentration dependent.Conclusion The inhibitory effection of progestogen to the ovary cancer cells and the expression of uPA of human ovary cancer cells indicated that progestogen might be adjunctive therapy of ovary cancer by mediating uPA.

Urokinase piasminogen activator(uPA); Ovarian cancer; Progestogen; Western blot

110000 遼寧省沈陽(yáng)市婦嬰醫(yī)院產(chǎn)一科(何芳)； 遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院婦產(chǎn)科(朱艷)