許沈南 李佳杰 盧旭生 張偉亮

膽總管囊腫患者與巨細(xì)胞病毒感染關(guān)系的相關(guān)性

許沈南 李佳杰 盧旭生 張偉亮

目的 探索人巨細(xì)胞病毒感染與膽總管囊腫的相關(guān)性。方法 使用人巨細(xì)胞病毒熒光定量PCR分別對(duì)25例膽總管囊腫和20例對(duì)照組患者肝臟組織進(jìn)行檢測(cè), 同時(shí)進(jìn)行病理染色和人巨細(xì)胞病毒晚期蛋白免疫組化檢測(cè)。結(jié)果 對(duì)照組均為檢測(cè)到陽(yáng)性結(jié)果, 實(shí)驗(yàn)組中, 人巨細(xì)胞病毒陽(yáng)性14例(陽(yáng)性率56%)。免疫組化結(jié)果顯示陽(yáng)性蛋白多位于肝細(xì)胞﹑血管內(nèi)皮細(xì)胞﹑炎癥浸潤(rùn)細(xì)胞當(dāng)中, 膽管上皮細(xì)胞呈強(qiáng)陽(yáng)性反應(yīng)。結(jié)論 膽總管囊腫與人巨細(xì)胞病毒感染之間存在密切相關(guān)性。

巨細(xì)胞病毒感染；膽總管囊腫

先天性膽總管囊腫(congenital choledochal cyst, CCC)是一種伴有膽汁淤積的外科膽道疾病, 是膽道系統(tǒng)常見(jiàn)先天畸形［1］。小兒膽總管囊腫穿孔在小兒時(shí)期很少見(jiàn), 一旦出現(xiàn)則病情重, 早期診斷較困難, 其發(fā)病機(jī)理至今尚不清楚。在臨床診治中發(fā)現(xiàn)巨細(xì)胞病毒(cytomegalo virus)與穿孔有一定的關(guān)聯(lián)［2］, 相關(guān)實(shí)驗(yàn)也提示該病與人巨細(xì)胞病毒感染之間存在相關(guān)性。因此本實(shí)驗(yàn)對(duì)膽總管囊腫患者及對(duì)照組患者肝臟組織中的人巨細(xì)胞病毒進(jìn)行檢測(cè), 為檢驗(yàn)和論證膽總管囊腫與人巨細(xì)胞病毒感染之間的相關(guān)性問(wèn)題提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 新鮮肝臟組織標(biāo)本源自普寧市人民醫(yī)院2010年～2013年施行手術(shù)的25例膽總管囊腫患者, 其中男13例,女12例。全部病例手術(shù)時(shí)年齡在2～8歲, 平均(4±2)歲。同時(shí)收集對(duì)照組病例20例, 均來(lái)自于本院意外死亡尸檢小兒。

1.2 方法 全部行B超及CT檢測(cè), 診斷為膽總管囊腫, 手術(shù)中進(jìn)一步探查, 證實(shí)為膽總管囊腫。術(shù)中切取直徑約1 cm的肝右葉邊緣組織, 分成兩份, 一份用甲醛固定, 另一份于-80℃超低溫冰箱中保存。

2 主要試劑及設(shè)備

DNA提取試采用 QIAGEN公司的QIAamp DNA Mini Kit,人巨細(xì)胞病毒檢測(cè)使用中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司生產(chǎn)的核酸擴(kuò)增熒光定量檢測(cè)試劑盒, HCMV 晚期蛋白PP65單克隆抗體購(gòu)自美國(guó) USCNLIFE 公司, 為兔抗人單克隆抗體,其余免疫組化試劑均購(gòu)自DAKO公司。

3 熒光定量PCR

取約40 mg的肝臟標(biāo)本提取DNA, 提取過(guò)程嚴(yán)格按照QIAGEN公司QIAamp DNA Mini Kit操作說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。熒光定量PCR反應(yīng)條件及結(jié)果判定均按照相應(yīng)的試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行, 反應(yīng)結(jié)束后使用7300 system SDS software進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與分析。具有反應(yīng)條件, 詳見(jiàn)表1。

表1 5種病毒FQ-PCR反應(yīng)條件

4 病理及免疫組織化學(xué)染色

肝臟組織使用甲醛固定后, 包埋成石蠟塊并進(jìn)行切片。病理染色方法包括HE 染色和MASSON染色。于此同時(shí), 采用二步法對(duì)人巨細(xì)胞病毒晚期蛋白PP65進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色, 以包漿內(nèi)有明顯棕黃色為陽(yáng)性。

5 結(jié)果

5.1 人巨細(xì)胞病毒在膽總管囊腫組織中的感染率 PCR結(jié)果顯示：25例膽總管囊腫患者肝臟組織中, HCMV陽(yáng)性者14例子, 陽(yáng)性率56%, 對(duì)照組20例HCMV均為陰性。

5.2 膽總管囊腫組織病理變化 膽總管囊腫患者肝臟組織病理結(jié)果顯示：肝小葉有不同程度的變性壞死, 部分可見(jiàn)肝多核巨細(xì)胞, 匯管區(qū)膽栓形成, 膽小管增生, 膽道上皮細(xì)胞變性。以膽小管為中心, 炎癥細(xì)胞侵潤(rùn), 不同程度的纖維束包裹膽小管。詳見(jiàn)圖1。

圖1 膽總管囊腫膽管及肝細(xì)胞病理學(xué)染色(400×)

5.3 膽總管囊腫組織PP65分布情況 PCR檢測(cè)HCMV檢測(cè)陽(yáng)性者, PP65免疫組化染色可見(jiàn)：PP65 均位于感染細(xì)胞胞漿當(dāng)中, 陽(yáng)性細(xì)胞多較集中分布于肝細(xì)胞﹑血管內(nèi)皮細(xì)胞﹑膽管上皮細(xì)胞和炎性浸潤(rùn)細(xì)胞, 膽道上皮細(xì)胞呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)。詳見(jiàn)圖2。

圖2 膽總管囊腫患者肝臟組織PP65免疫組化染色

6 討論

CMV是一種DNA病毒。HCMV是人體最常見(jiàn)的機(jī)會(huì)性感染病毒之一。用檢測(cè)方法調(diào)查HCMV感染率, 發(fā)達(dá)國(guó)家人群感染率40%～60%, 發(fā)展中國(guó)家95%～99%。近年來(lái), 隨著研究的深入, 很多學(xué)者已認(rèn)識(shí)到膽總管囊腫不能簡(jiǎn)單歸于先天性疾病, 而更可能是圍生期的一種進(jìn)行性病變。其明顯的季節(jié)和地區(qū)聚集趨勢(shì)的特點(diǎn)提示該病可能與環(huán)境中某種感染因素的損傷有關(guān)［2］。隨后相關(guān)的研究也表明病毒感染與膽總管囊腫存在相關(guān)性［3］。

但具體是哪一種病毒卻值得探索, 近年來(lái)人們采用多種方法對(duì)膽總管囊腫和多種病毒感染之間的相關(guān)性問(wèn)題進(jìn)行研究, 相關(guān)研究也證實(shí)該病與多種病毒之間存在相關(guān)性, 其中主要病毒包括呼腸病毒﹑輪狀病毒和巨細(xì)胞病毒3大類［4-6］。

本實(shí)驗(yàn)使用PCR方法直接檢測(cè)患者肝臟組織當(dāng)中HCMV的陽(yáng)性率, 并使用尸檢患兒肝臟組織作為對(duì)照組, 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示膽總管囊腫患者的陽(yáng)性率高達(dá)56%, 而對(duì)照組則未有陽(yáng)性病例。此數(shù)據(jù)與國(guó)內(nèi)董永綏等［7］進(jìn)行大規(guī)模前瞻性研究得出的普通嬰幼兒CMV肝炎發(fā)生率(42%)相比, 提示BA病因?yàn)镠CMV感染的可能。進(jìn)一步提示了膽總管囊腫與巨細(xì)胞病毒的相關(guān)性。

于此同時(shí), 作者注意到膽總管囊腫患者的膽道上皮細(xì)胞上HCMV晚期蛋白PP65的表達(dá)呈強(qiáng)陽(yáng)性, 且膽道上皮細(xì)胞亦出現(xiàn)凋亡現(xiàn)象。提示HCMV對(duì)膽總管囊腫患兒的膽道上皮細(xì)胞具有侵襲性, 可誘發(fā)膽道上皮細(xì)胞的凋亡, 從而影響膽小管的功能與結(jié)構(gòu)。

將通過(guò)動(dòng)物學(xué)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)本次研究的檢測(cè)結(jié)果, 將HCMV打入到胎鼠當(dāng)中, 觀察其膽道的變化。HCMV與膽總管囊腫之間存在相關(guān)性, 可謂臨床上膽總管囊腫的防治提供科研依據(jù), 造?；純?。

［1］ Alford CA, Stagno S, Pass RF, Britt WJ.Congenital and Perinatal cytomegalovirus infections.Res Infect Dis , 1990, 125Suppl7:S745-753.

［2］ Wu T C, Hruban R H, Ambinder R F, et al.Demonstration of cytomegalovirus nucleic acids in the coronary arteries of transplanted hearts.The American journal of pathology, 1992, 140(3): 739.

［3］ 馮杰雄.病毒感染與膽總管囊腫的關(guān)系.實(shí)用兒科臨床雜志, 2007, 22( 23):1761-1763.

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Correlation of congenital choledochal cyst and cytornegalovirus infection

XU Shen-nan, LI Jia-jie, LU Xu-sheng, et al.

Puning People's Hostpital, Puning 515300, China

Objective To explore the relationship between human cytomegalovirus and choledochal cyst.Methods Fluorescent quantitative PCR (FQ-PCR) was used to detect the liver tissue of human cytomegaloviru in 25 cases of choledochal cyst and 20 cases of control group.Meanwhile, immunohistochemistry was used to detect the human cytomegalovirus late proteins PP65 with the paraffin section.Results Among 25 cases of choledochal cyst, 14 cases (56%) were found to be positive for HCMV, meanwhile, the immunohistochemistry result showed that PP65 was located in the cytoplasm of infected cells such as liver cells, vascular endothelial cells, bile duct epithelial cells and inflammatory infiltrating cells.Conclusion HCMV has a close relationship with choledochal cyst.

Cytomegalovirus infection; Choledochal cyst

515300 廣東省普寧市人民醫(yī)院外二科