王桂杰 李 巖

·論著·

中藥軟肝寧對(duì)實(shí)驗(yàn)性肝纖維化大鼠TGFβ1、Smad2/3表達(dá)的影響

王桂杰 李 巖

目的 觀察四氯化碳(CCl4)誘導(dǎo)大鼠肝纖維化后應(yīng)用軟肝寧的療效及作用機(jī)制。方法 用40% CCl4對(duì)Wistar大鼠造模8周, 將50只分為中藥預(yù)防組、中藥治療組、模型對(duì)照組及正常對(duì)照組,用軟肝寧于造模第1周及第4周開始灌胃。運(yùn)用免疫組織化學(xué)(S-P)技術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(TGFβ1)、Smad2/3在肝內(nèi)表達(dá), 堿水解法檢測(cè)肝組織羥脯胺酸(Hyp)含量, 酶聯(lián)免疫法檢測(cè)肝組織內(nèi)透明質(zhì)酸(HA)的含量。結(jié)果 經(jīng)軟肝寧防治后大鼠肝組織內(nèi)TGFβ1、Smad2/3表達(dá)減少, 透明質(zhì)酸、羥脯胺酸水平降低。結(jié)論 復(fù)方中藥制劑軟肝寧能有效地逆轉(zhuǎn)四氯化碳誘導(dǎo)肝纖維化大鼠的纖維化, 其機(jī)理可能是抑制肝內(nèi)TGFβ1、Smad2/3 表達(dá)。

中藥；肝纖維化； 羥脯胺酸；透明質(zhì)酸；轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1；Samd2/3

本文針對(duì)肝纖維化“瘀血”、“癥積痞塊”所致病理癥結(jié),擬以疏肝理脾、活血化瘀治療原則的軟肝寧方劑, 進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究, 以期闡明該方治療肝纖維化的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 由中國(guó)醫(yī)科大學(xué)第二臨床學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供的雌雄各半、清潔級(jí) Wistar大鼠50只。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)藥物 軟肝寧內(nèi)含柴胡20 g、白術(shù)12 g、桃仁12 g等, 購(gòu)于遼寧中醫(yī)學(xué)院藥劑科, 煎好用干燥箱加工成顆粒劑備用, 用前溶解成濃度0.4 g/ml的溶液。

1.2 儀器與試劑

1.2.1 模型制備 肝纖維化大鼠模型制作參照Mont fort等方法略加改進(jìn)。Wistar 大鼠, 雌雄各半, 體質(zhì)量160～260 g,按2 ml/kg體質(zhì)量, 2次/周腹腔注射40 % CCl4造模8周。

1.2.2 主要試劑 羥脯胺酸(Hyp)試劑盒購(gòu)于南京建成生物工程研究所；透明質(zhì)酸(HA)試劑盒購(gòu)于上海森雄科技實(shí)業(yè)有限公司；免疫組織化學(xué)TGFβ1、Smad2/3一抗及二抗試劑盒購(gòu)自武漢博士德生物技術(shù)有限公司。

1.2.3 主要儀器 全自動(dòng)圖像分析系統(tǒng)為C5050及圖像分析軟件。

1.3 方法

1.3.1 分組及用藥 大鼠50只, 隨機(jī)分為四組：A組為正常組(即空白對(duì)照組)(n=8), B組為肝纖維化模型組(n=12), C組為中藥預(yù)防組(n=12), D組為中藥治療組(n=18)。B、C、D組造膜, C、D 組分別于造模第1、4周開始中藥軟肝寧灌胃, C組、D組3 ml/kg灌胃。全部大鼠于第8 周末處死, 處死前稱體質(zhì)量, 剖腹取肝右葉于10%中性甲醛固定, 余肝組織-70℃冰箱保存。

1.3.2 實(shí)驗(yàn)方法 HA均需要肝勻漿制備：肝組織解凍后,生理鹽水反復(fù)沖洗, 濾紙吸干, 切取小塊, 電子分析天平精確稱重(150±5)mg, 置于干凈試管內(nèi), 按1 1:9加入生理鹽水,高速分散器勻漿, 低溫高速離心機(jī)3000 r/min , 15 min后, 取上清液, 以上操作均于冰浴中進(jìn)行, 應(yīng)用酶聯(lián)免疫法按試劑盒說明進(jìn)行檢測(cè)。Hyp檢測(cè)為堿水解法, 按試劑盒說明進(jìn)行。免疫組化采用S -P法檢測(cè), 按照試劑盒說明書操作。

1.3.3 免疫組化結(jié)果量化 隨機(jī)選取每張切片6個(gè)視野(×400倍), 采用全自動(dòng)圖像分析進(jìn)行定量分析, 測(cè)定陽(yáng)性細(xì)胞的吸光度(A值)及面積, 以兩者乘積表示組織中該抗原相對(duì)含量, 乘積越大表示抗原含量越高。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析, 計(jì)量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(s)表示, 采用t檢驗(yàn), P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 動(dòng)物一般狀況觀察 模型組大鼠從實(shí)驗(yàn)開始后1 周起每次腹腔注射后興奮, 躁動(dòng)不安。隨著造模時(shí)間延長(zhǎng), 飲食下降, 喜臥, 毛色漸無光澤, 大便稀軟不成形, 體質(zhì)量明顯比正常組低, 精神萎靡不振。應(yīng)用軟肝寧灌胃后飲食好轉(zhuǎn)、體質(zhì)量增加。實(shí)驗(yàn)過程中B組大鼠死亡4只, C組實(shí)驗(yàn)中死亡3只, D組實(shí)驗(yàn)中死亡5只, 實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)各組大鼠數(shù)量: 正常組8只, 模型組8 只, 中藥預(yù)防組9只, 中藥治療組13只。實(shí)驗(yàn)終末A組平均每只體質(zhì)量增加(107.00±12.20)g；B組每只體質(zhì)量增加(45.75±10.01)g；顯著低于A 組(P＜0.01)；C組平均每只體質(zhì)量增加(65.2±9.3)g, D組平均每只體質(zhì)量增加(63.85±10.86)g, C、D組與A組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。

2.2 TGFβ1、Smad2/3在肝組織中的表達(dá)與分布 陽(yáng)性組織呈棕色, 陰性部分呈藍(lán)色。①A組肝組織: Smad2/3在正常肝細(xì)胞內(nèi), 匯管區(qū)基質(zhì)及間質(zhì)細(xì)胞胞漿內(nèi)均無表達(dá), TGFβ1在上述部位無表達(dá), 在Disse 間隙偶有表達(dá)。②B組肝組織: 肝內(nèi)TGFβ1、Smad2/3表達(dá)明顯強(qiáng), TGFβ1表達(dá)極為強(qiáng)烈, 陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目明顯增多, 主要見于小葉周圍擴(kuò)大的纖維組織內(nèi)的成纖維細(xì)胞、竇周細(xì)胞、炎性細(xì)胞以及增生的膽小管周圍梭狀細(xì)胞及肝細(xì)胞內(nèi), 陽(yáng)性物質(zhì)主要集中在胞漿內(nèi), 胞膜上也有少量表達(dá)。本組肝組織Smad2/3 表達(dá)主要集中在肝細(xì)胞胞漿內(nèi), 陽(yáng)性細(xì)胞著色棕黃。③ C、D組：TGFβ1、Smad2/3在肝組織內(nèi)的表達(dá)量較B組減少, 陽(yáng)性表達(dá)集中同B組, 陽(yáng)性程度弱于B 組, D組表達(dá)明顯強(qiáng)于C組。各種成分在不同實(shí)驗(yàn)組中表達(dá)經(jīng)計(jì)算機(jī)軟件分析結(jié)果,見表1, 圖1。

表1 中藥對(duì)大鼠肝組織中TGFβ1、Smad2/3平均光密度表達(dá)量化結(jié)果的影響(s)

表1 中藥對(duì)大鼠肝組織中TGFβ1、Smad2/3平均光密度表達(dá)量化結(jié)果的影響(s)

注：與正常組比較aP＜0.01；與模型組比較bP＜0.01；與治療組比較cP＜0.05；與治療組比較dP＞0.05

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圖1 中藥對(duì)各組大鼠肝組織中TGFβ1和Smad2/3光密度量化結(jié)果的影響

2.3 中藥軟肝寧對(duì)CCl4肝纖維化大鼠肝組織的Hyp、HA影響 試驗(yàn)結(jié)束時(shí)模型組肝組織Hyp、HA數(shù)值遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于正常組, 而中藥治療組和中藥預(yù)防組Hyp、HA數(shù)值低于模型組。各組與正常組比較, 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01), 預(yù)防組、治療組與模型組比較, 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01), 預(yù)防組觀察指標(biāo)雖明顯優(yōu)于治療組, 但兩者比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。具體結(jié)果見表2。

表2 各組大鼠肝組織Hyp及HA比較(s)

表2 各組大鼠肝組織Hyp及HA比較(s)

注：與正常組比較bP＜0.01, 與模型組比較aP＜0.01, 與治療組比較cP＞0.05

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3 討論

軟肝寧方劑中柴胡為君藥疏肝, 臣藥炒白術(shù)補(bǔ)脾, 再配以丹參、川芎、桃仁等活血化瘀, 符合中醫(yī)辨證治療纖維化原則。方中丹參能夠顯著抑制成纖維細(xì)胞的增生, 使星狀細(xì)胞凋亡［1］。川芎嗪能減少透明質(zhì)酸和膠原產(chǎn)生, 并提高肝組織SOD的活性, 減少TGFβ1和Smad 2/3的分泌, 從而抑制肝星狀細(xì)胞活化, 減緩肝纖維增生的程度［2］。桃仁主要含扁桃甙, 抗肝纖維化機(jī)制是能增加肝血流量, 降低肝組織膠原含量, 促進(jìn)肝內(nèi)纖維膠原分解代謝［3］。

TGFβ1是目前已知的加快肝纖維化的最重要細(xì)胞因子之一［4］。在肝臟中肝星狀細(xì)胞、肝細(xì)胞、枯否氏細(xì)胞、血小板等多種細(xì)胞產(chǎn)生此種因子, 可促進(jìn)HSC活化并分泌多種膠原,激活靜止?fàn)顟B(tài)的HSC, 抑制細(xì)胞外基質(zhì)( ECM)降解、進(jìn)而抑制肝細(xì)胞再生［5］。Smads 蛋白TGFβ1超家族的信號(hào)在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)的蛋白, 是TGFβ/Smad信號(hào)通路中組成部分, 在調(diào)控TGFβ1介導(dǎo)的細(xì)胞外基質(zhì)積聚過程中起作用, 能介導(dǎo)TGFβ1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo), 促進(jìn)肝纖維化形成。Smad2和Smad3是Ⅰ型受體激酶的底物, 兩者介導(dǎo)類似的信號(hào)且氨基酸序列高度同源。TGFβ1同時(shí)使Smad2和Smad3磷酸化, 是TGFβ/Smad信號(hào)轉(zhuǎn)運(yùn)通路中的橋梁, 抑制它們的生成、核轉(zhuǎn)位和磷酸化, 進(jìn)而抑制肝纖維化, 其中Smad3與肝纖維化的關(guān)系最為密切［6,7］。

肝星狀細(xì)胞能產(chǎn)生HA, 其內(nèi)皮細(xì)胞中降解, 肝纖維化時(shí)產(chǎn)生增加。肝纖維化時(shí)肝星狀細(xì)胞合成HA增加, 攝取降解減少, 是判定肝纖維化活動(dòng)較敏感的指標(biāo)［8,9］。肝細(xì)胞受損后釋放出羥脯胺酸, 它是肝臟膠原蛋白獨(dú)有的氨基酸, 測(cè)定其含量, 可確定膠原總體含量, 可推算膠原增生與肝纖維化程度［10］。

本實(shí)驗(yàn)隨著CCl4給藥時(shí)間的增長(zhǎng), 大鼠肝組織透明質(zhì)酸和羥脯胺酸結(jié)果顯示, 模型組大鼠HA、Hyp數(shù)值升高, 中藥預(yù)防組和治療組, HA、Hyp數(shù)值也有所升高, 這三組與正常組相比P＜0.01, 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本實(shí)驗(yàn)說明隨著肝纖維化表現(xiàn)的加重, 肝組織內(nèi)反映肝纖維化指標(biāo)HA、Hyp的數(shù)值也相應(yīng)升高, 而應(yīng)用中藥可降低肝細(xì)胞中Hyp、HA。

Wistar大鼠肝組織中TGFβ1、Smad2/3免疫組化染色顯示：模型組顯微鏡下陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量及分布范圍明多于中藥治療組和預(yù)防組, 計(jì)算機(jī)光密度分析數(shù)據(jù)與鏡下觀測(cè)結(jié)論一致,模型組與預(yù)防組和治療組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。這說明中藥軟肝寧是通過減少活化的星狀細(xì)胞分泌TGFβ1、減輕細(xì)胞的壞死和變性, 恢復(fù)肝功能, 抑制膠原沉積和生成,抑制肝細(xì)胞內(nèi)Smad2和Smad3蛋白質(zhì)的表達(dá)和磷酸化, 減少TGFβ1表達(dá), 抑制星狀合成膠和原［11］。由此研究可進(jìn)一步得出結(jié)論：肝組織中Smad2/3蛋白質(zhì)增多, TGFβ1分泌增加導(dǎo)致肝星狀細(xì)胞增殖, 它們之間正相關(guān), 與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道相似［7］。

本研究表明復(fù)方中藥方軟肝寧能延緩肝纖維化, 其機(jī)制可能是抑制TGFβ1表達(dá)其下游信號(hào)Smad2/3, 減少肝內(nèi)膠原生成和沉淀, 減輕免疫損害, 降低肝臟的纖維化, 可臨床推廣價(jià)值此類復(fù)方中藥。

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Effect of traditional Chinese medicine Ruan Gan Ning on the expression of TGFβ1and Smad2/3 in the experimental rat hepatic fibrosis

WANG Gui-jie.LI Yan.Shengyang Sixth People's Hopspital, Shenyang 110006, China

Objective To observe the therapeutic effect and mechanism of Ruan Gan Ning on the rat hepatic fibrosis induced by carbon tetrachloride(CCL4).Methods 50 Wistar rats were divided into normal control , model control, TCM prevention and TCM therapy groups.At the first and forth week of model-making, the rats were given Ruan Gan Ning through intragastric administration.The expression of TGFβ1and Smad2/3 in the liver tissue was detected with immunohistochemistry(S-P) and the content of Hyp with alkaline hydrolysis, the content of hyaluronic acid(HA) with euzymelinked immunosorbent assay.Results After the application of Ruan Gan Ning the expression of TGFβ1, Smad2/3 and the level of HA and Hypdecreased in the experimental rat hepatic fibrosis.Conclusion Ruan Gan Ning can relieve the rat hepatic fibrosis induced by CCL4 a nd the mechanism of action may be its inhibition of expression of TGFβ1, Smad2/3 in the liver tissue.

Traditional Chinese medicine; Hepatic fibrosis; Hyaluronic acid; Transforming growth factor β1; Smad2/3

2014-03-20］

110006 遼寧省沈陽(yáng)市第六人民醫(yī)院消化門診(王桂杰)；中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院消化內(nèi)科(李巖)

王桂杰