鮑 鑫 ，蔡 標(biāo) ，2，王 艷 ，2，梁 杰 ，李珊珊

（1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)，安徽合肥230038； 2.安徽省中醫(yī)藥科學(xué)院，安徽合肥230038）

目前，中國已進(jìn)入老齡化社會(huì)，阿爾茨海默?。ˋlzheimer′s disease，AD）的高發(fā)病率已引起醫(yī)學(xué)界的高度關(guān)注，它是一種進(jìn)行性神經(jīng)退行性疾病。染料木素（Genistein，GS）是大豆異黃酮最主要活性成分，與人類雌激素結(jié)構(gòu)相似，與雌激素受體（ER）特別是雌激素受體β（ERβ）有較高的親和力，具有弱雌激素樣作用［1-3］。因此，GS成為雌激素的天然替代品。相關(guān)研究表明，GS能使海馬和皮質(zhì)神經(jīng)凋亡的數(shù)量減少，對(duì)體外培養(yǎng)的皮層和海馬神經(jīng)元起到保護(hù)作用［4］，在防治AD中能通過對(duì)抗β淀粉樣蛋白的毒性保護(hù)神經(jīng)［5］。本實(shí)驗(yàn)通過觀察染料木素對(duì)AD大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響和海馬組織形態(tài)學(xué)變化，檢測AD大鼠海馬組織鈣調(diào)蛋白（calmodulin，CaM）含量、海馬組織環(huán)腺苷酸反應(yīng)元件結(jié)合蛋白（cAMP response element-binding protein，CREB）、磷酸化 CREB（p-CREB）的表達(dá)，研究染料木素對(duì)阿爾茨海默病大鼠海馬CaM-CREB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響，探討染料木素預(yù)防AD、改善學(xué)習(xí)記憶功能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選用安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供的體重250 g～350 g的10月齡SD雌性大鼠120只［清潔級(jí)，合格證SXCK（皖）2011-002］。自由攝食與飲水。

1.1.2 藥物與試劑 染料木素（純度90%，Sigma公司提供，批號(hào)110223）；羧甲基纖維素鈉（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司提供，批號(hào) F20101221）；Aβ25～35（Sigma公司提供，批號(hào)108K4794）；戊酸雌二醇片（Estradiol Valerate，EV）（DELPHARM Lille S.A.S 公司提供，批號(hào)142A）；CaM測定試劑盒（上?；顦飞锟萍加邢薰荆?hào) 20110569）；CREB（一抗，美國Stancruz公司提供，批號(hào)BS1624）；p-CREBS133（一抗，美國Stancruz公司提供，批號(hào)BS4053）；二抗試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，批號(hào)812251A）。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 雙臂數(shù)字式腦立體定位儀（美國stoelting產(chǎn)品）；RWD-202微量注射泵（深圳瑞沃德生命科技有限公司產(chǎn)品）；722N型分光光度計(jì)（上海精密科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品）；Multiskan MK2型酶標(biāo)儀（Labsystem產(chǎn)品）；Wellwash 4 MK2型洗板機(jī)（Labsystem產(chǎn)品）；移液器（Eppendorf產(chǎn)品）；BX51型光學(xué)顯微鏡（日本OLYMPUS產(chǎn)品）；JEDA 801D圖像采集處理系統(tǒng)（江蘇捷達(dá)產(chǎn)品）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 分組與給藥 將120大鼠隨機(jī)分為空白組（Blank）、模型組（OVX）、染料木素高劑量組（GS-H，90 mg/kg）、染料木素中劑量組（GS-M，30 mg/kg）、染料木素低劑量組（GS-L，10 mg/kg）、雌激素陽性對(duì)照組（戊酸雌二醇組，EV，0.4 mg/kg）6組，每組20只。預(yù)先給藥7 d后，以D-半乳糖聯(lián)合Aβ25～35誘導(dǎo)制備AD大鼠模型［6］，連續(xù)28 d。用0.5%羧甲基纖維素鈉將染料木素分別配成濃度為9 mg/mL（GS-H組）、3 mg/mL（GS-M組）、1 mg/mL（GS-L組）的混懸液，蒸餾水加戊酸雌二醇配制成濃度為0.04 mg/mL的溶液。每組每天灌胃給予相應(yīng)的藥物（1 mL/100 g），模型組給予等量的0.5%羧甲基纖維素鈉?？瞻捉M正常喂養(yǎng)。

1.2.2 造模 大鼠經(jīng)腹腔注射10%水合氯醛380 mg/kg麻醉后，固定于腦立體定位儀上。無菌條件下操作，沿頭頂部正中線1 cm縱向切口，暴露前囟，參照大鼠腦立體定位圖譜，以前囟為原點(diǎn)，旁2.2 cm，后4.4 cm為穿刺點(diǎn)，鉆孔穿顱。進(jìn)針深度3.0 mm至雙側(cè)海馬，一次性注射 Aβ25~351 μL（10 μg），5 min內(nèi)緩慢注入，并留針5 min。傷口撒少許青霉素鈉粉末后進(jìn)行縫合，碘酒常規(guī)消毒，術(shù)后連續(xù)3 d腹腔注射青霉素鈉預(yù)防感染［6］?？瞻捉M不做處理。

1.2.3 取材 治療結(jié)束后，各組取10只大鼠，經(jīng)腹腔注射10%水合氯醛380 mg/kg麻醉后，快速在生理鹽水冰面上取腦，分離海馬組織，稱取組織重量加9倍生理鹽水，冰浴中3000 r/min離心10 min，勻漿10次，制備成10%腦勻漿。-80℃冰箱中保存，待測CaM含量。每組取10只經(jīng)心臟行灌注固定：經(jīng)腹腔注射10%水合氯醛380 mg/kg麻醉后，剪開胸廓找到心臟，于心尖處插入灌注針頭，快速滴入冷生理鹽水200 mL，接著注入350 mL 4%多聚甲醛，取出腦組織后置于4%多聚甲醛中放入4℃冰箱固定。待觀察大鼠海馬組織形態(tài)結(jié)構(gòu)變化及CREB、p-CREB表達(dá)。

1.2.4 檢測指標(biāo) 造模后15 d對(duì)各組大鼠進(jìn)行Morris水迷宮訓(xùn)練觀察GS對(duì)AD大鼠學(xué)習(xí)記憶的影響。訓(xùn)練1次/d，共6 d。訓(xùn)練時(shí)選擇1個(gè)入水點(diǎn)，將大鼠面向池壁放入水中，觀察并記錄大鼠尋找并爬上平臺(tái)所需時(shí)間（逃避潛伏期）。如果大鼠在120 s內(nèi)未找到平臺(tái)，需將其引至平臺(tái)，這時(shí)潛伏期為120 s。訓(xùn)練期間水溫保持在（26±1）℃，迷宮外參照物保持不變。將各組第6天的成績進(jìn)行比較，數(shù)據(jù)采集和處理由Morris水迷宮圖像自動(dòng)監(jiān)視處理系統(tǒng)完成。

將固定的大鼠腦組織進(jìn)行常規(guī)病理切片和HE染色后，觀察海馬組織形態(tài)并進(jìn)行圖像采集。采用ELISA法按試劑盒說明檢測AD大鼠CaM含量。采用免疫組化SP法檢測海馬組織CREB、p-CREB。嚴(yán)格按照試劑盒操作方法，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，最后脫片、透明及封片。

在顯微鏡下觀察每張切片海馬 CA1、CA2、CA3、CA4區(qū)域并隨機(jī)各取1個(gè)視野拍照。神經(jīng)元胞核內(nèi)染棕黃色為CREB或p-CREB陽性表達(dá)，采用JEDA 801D形態(tài)學(xué)圖像分析系統(tǒng)拍照并統(tǒng)計(jì)陽性表達(dá)的平均光密度（mean optical density，MOD）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。組間用單因素方差分析，多組之間兩兩比較采用LSD法，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 對(duì)AD大鼠Morris水迷宮成績的影響

Morris 水迷宮實(shí)驗(yàn)顯示，Blank、OVX、GS-H、GS-M、GS-L、EV組大鼠逃避潛伏期分別為（15.79±6.42）s，（24.55±7.10）s，（13.58±7.30）s，（16.39±5.07）s，（17.67±6.87）s，（17.51±7.83）s。與空白組對(duì)比，模型組逃避潛伏期明顯延長（P＜0.01）；與模型組比較，染料木素高、中、低劑量組和戊酸雌二醇組逃避潛伏期明顯縮短（P＜0.01）；與戊酸雌二醇組相比，染料木素高劑量組逃避潛伏期顯著縮短（P<0.05），染料木素中、低劑量組逃避潛伏期差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2 對(duì)AD大鼠海馬組織形態(tài)學(xué)變化的影響

在光鏡下觀察，Blank組大鼠的海馬細(xì)胞染色均勻，胞核完整、形態(tài)完好呈錐形、排列規(guī)則。GS-H組神經(jīng)細(xì)胞排列緊密，染色均勻。模型組海馬神經(jīng)細(xì)胞排列紊亂，數(shù)量減少且層數(shù)也減少，錐體細(xì)胞顆粒空泡變性，并出現(xiàn)許多有空暈的固縮細(xì)胞。GS-M組腦組織神經(jīng)細(xì)胞少數(shù)出現(xiàn)上述變化。GS-L組胞核固縮的神經(jīng)細(xì)胞多見，EV組神經(jīng)細(xì)胞破裂者較多。結(jié)果見圖1。

圖1 各組大鼠海馬組織CA3區(qū)形態(tài)結(jié)構(gòu)變化（HE×400）

2.3 對(duì)AD大鼠海馬CaM含量、CREB及p-CREB表達(dá)的影響

由表1可見，與Blank組比較，OVX組海馬組織CaM含量、CREB及p-CREB的MOD顯著升高（P<0.01）；與OVX組比較，染色木素各劑量組、EV組海馬組織CaM含量及CREB及p-CREB的MOD均顯著降低（P<0.05，P<0.01）；與 EV 組比較，GS-L組p-CREB的MOD顯著升高（P<0.05）。Blank組大鼠海馬組織 CREB、p-CREB呈輕度表達(dá)；OVX組CREB、p-CREB呈強(qiáng)陽性表達(dá)；GS-H組、GS-M組和 EV組 CREB、p-CREB呈中度表達(dá)；GS-L組CREB、p-CREB呈高度表達(dá)。結(jié)果見表1、圖2、圖3。

表1 染料木素對(duì)AD大鼠海馬CaM含量、CREB及p-CREB表達(dá)的影響 （±s）

表1 染料木素對(duì)AD大鼠海馬CaM含量、CREB及p-CREB表達(dá)的影響 （±s）

注：與 Blank 組比較，1）P<0.01；與 OVX 組比較，2）P<0.05，3）P<0.01；與 EV 組比較，4）P<0.05

組別n劑量（mg/kg）CaM/（ng/L）CREB（MOD）p-CREB（MOD）Blank 組 10 - 80.51±9.980.252±0.0120.219±0.021 OVX 組 10 - 93.75±9.851） 0.350±0.0211） 0.325±0.0181）GS-H 組 109073.79±6.153） 0.272±0.0192） 0.267±0.0162）GS-M 組 103078.96±12.973） 0.284±0.0142） 0.281±0.0202）GS-L 組 101082.50±7.282） 0.291±0.0202） 0.289±0.0172）4）EV 組 100.474.78±9.243） 0.282±0.0162） 0.269±0.0112）

圖2 各組大鼠海馬組織CA3區(qū)CREB的表達(dá)（SP×400）

3 討 論

圖3 各組大鼠海馬組織CA3區(qū)p-CREB的表達(dá)（SP×400）

海馬是學(xué)習(xí)記憶的重要部位，而AD病的最顯著特征之一就是學(xué)習(xí)記憶能力障礙。AD的主要病理變化為腦內(nèi)神經(jīng)細(xì)胞顆?？张輼幼冃砸约吧窠?jīng)原纖維纏結(jié)（Neurofibrillary tangles，NFT）［7］。實(shí)驗(yàn)證明，雌激素水平增高時(shí)，可以對(duì)受損的神經(jīng)元發(fā)揮保護(hù)效應(yīng)，抑制凋亡，減少AD的發(fā)生［8］。而GS具有類雌激素樣的作用，是防治AD的理想藥物。腦內(nèi)注射Aβ25-35可以出現(xiàn)類似AD的病理變化，因此本實(shí)驗(yàn)采用了Aβ25-35造模。海馬組織病理切片觀察顯示，Blank組海馬組織神經(jīng)細(xì)胞排列整齊。OVX組海馬CA1區(qū)神經(jīng)元排列紊亂，層數(shù)減少，神經(jīng)元數(shù)目較假手術(shù)組明顯減少。錐體細(xì)胞顆?？张輼幼冃裕糠旨?xì)胞凋亡，出現(xiàn)體積縮小，細(xì)胞核破裂至細(xì)胞呈紅色。GS-H組海馬CA1區(qū)的錐體細(xì)胞顆?？张輼幼冃詼p少，神經(jīng)細(xì)胞丟失明顯減少。低、中劑量組也有類似變化。

AD的發(fā)病與神經(jīng)元鈣穩(wěn)態(tài)失調(diào)有關(guān)，這種失調(diào)發(fā)生于神經(jīng)元、星型膠質(zhì)、少突膠質(zhì)和小膠質(zhì)細(xì)胞中，直接導(dǎo)致神經(jīng)元結(jié)構(gòu)和功能的失常及細(xì)胞的壞死［9］。CaM是細(xì)胞中一種重要的多功能蛋白，它可以激活40多種酶或者通道，參與許多生物功能。CaM不僅參與了神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞的信號(hào)級(jí)聯(lián)放大系統(tǒng)，參與突觸可塑性、細(xì)胞分化和增生，還在長時(shí)程增強(qiáng)效應(yīng)和學(xué)習(xí)記憶中起重要作用［10-11］。AD發(fā)病時(shí)神經(jīng)元內(nèi)Ca2+超載，Ca2+激活鈣調(diào)蛋白（CaM），成為有活性的鈣-鈣調(diào)蛋白復(fù)合物（Ca2+/CaM）。Ca2+/CaM激活鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶Ⅱ（calmodulindependent protein kinase Ⅱ，CaMKII），CaMKII可使CREB磷酸化，磷酸化CREB激活下游調(diào)控基因的表達(dá)，最終導(dǎo)致神經(jīng)元損傷/抗損傷平衡的失調(diào)而引起細(xì)胞死亡，引起記憶功能障礙，最終形成AD。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：在Aβ海馬注射造AD大鼠模型后，大鼠海馬CaM、CREB和p-CREB蛋白表達(dá)增加，染料木素可明顯改善AD大鼠學(xué)習(xí)記憶能力；染料木素可明顯減少AD大鼠海馬組織神經(jīng)元的丟失，具有神經(jīng)保護(hù)作用；染料木素可顯著性降低AD大鼠海馬組織CaM的含量，降低海馬組織CREB和p-CREB的表達(dá)。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，染料木素可能通過減少Aβ在大鼠海馬的沉積，減少神經(jīng)元鈣超載以穩(wěn)定神經(jīng)元鈣穩(wěn)態(tài)平衡，從而減少CaM、CREB和磷酸化CREB的含量，減少海馬神經(jīng)元丟失，改善學(xué)習(xí)記憶的能力，起到預(yù)防AD的作用。

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