郭 羽，薛慧清，高 麗，岳曉華，劉必旺

（山西中醫(yī)學院，山西太原030024）

黃芪是中醫(yī)臨床常用的傳統(tǒng)滋補中藥材，具有補氣固表、利水消腫、托毒排膿、斂瘡生肌的功效［1］?，F(xiàn)代醫(yī)學研究表明，黃芪含皂苷、黃酮、多糖以及多種氨基酸和微量元素等活性物質(zhì)，具有增強機體免疫功能、抗衰老、抗腫瘤、抗病毒和較廣泛的抗菌作用，對痢疾桿菌、炭疽桿菌、白喉桿菌、葡萄球菌、鏈球菌、肺炎雙球菌等均有抗菌作用［2］。

中藥發(fā)酵技術(shù)是在傳統(tǒng)微生物發(fā)酵炮制的基礎上，結(jié)合現(xiàn)代生物技術(shù)而形成的一種中藥制藥新技術(shù)，為中醫(yī)藥現(xiàn)代化研究和中藥材資源的高效利用提供了新的思路［3］。以中藥材為發(fā)酵基質(zhì)，微生物細胞能夠以其特有的酶系和代謝方式進行合成或轉(zhuǎn)化，使某些活性成分的含量提高或產(chǎn)生新的活性物質(zhì)，從而提高藥效，節(jié)約資源。本研究以生長繁殖快、發(fā)酵能力強的釀酒酵母為發(fā)酵菌種，以黃芪為基質(zhì)進行酵母菌發(fā)酵，研究經(jīng)酵母菌轉(zhuǎn)化的黃芪發(fā)酵液的抑菌活性，為黃芪的現(xiàn)代化研究提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 昆明種小鼠，雌雄各半，體重18 g~22 g，購自山西醫(yī)科大學實驗動物中心。

1.1.2 實驗藥材 黃芪藥材購自產(chǎn)地山西應縣，經(jīng)山西中醫(yī)學院實驗管理中心尚彩玲老師鑒定為豆科植物蒙古黃芪，發(fā)酵前粉碎成65目粉末。發(fā)酵菌株：釀酒酵母（saccharomyces cerevisiae），由山西大學生物技術(shù)研究所惠贈；受試菌株：金黃色葡萄球菌（staphylococcus aureus）、大腸桿菌（escherichia coli）、肺炎鏈球菌（streptococcus pneumoniae）、綠膿桿菌（pseudomonas aeruginosa）、普通變形桿菌（proteus vulgaris）由山西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院提供。

1.1.3 試劑與儀器 營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，杭州天和生物技術(shù)有限公司；青霉素、鏈霉素，上海生工。高壓蒸汽滅菌器（山東新華醫(yī)療器械公司）、BBS-DSC超凈工作臺（上海巴艾貝斯有限公司）、THZ-D臺式恒溫振蕩器（海門市林貝儀器制造有限公司）、離心機（安徽中科中佳儀器公司）、電子天平（德國Sartorius公司）、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（德國Heidolph公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 黃芪酵母菌發(fā)酵液的制備及預處理 將低溫保藏的釀酒酵母菌種斜面活化3次，液體搖瓶培養(yǎng)1次，作為液體種子備用。無菌條件下將10 g黃芪藥材粉末加入100 mL豆芽汁培養(yǎng)基中，按10%接種量接入酵母菌液體種子，28℃、150 r/min，恒溫振蕩培養(yǎng)7 d。發(fā)酵液8000 r/min離心15 min，取上清液，經(jīng)抽濾后置于旋蒸儀上濃縮，過濾除菌，分別配成質(zhì)量濃度為0.1 g/mL，1.0 g/mL，2.5 g/mL的藥液備用。

1.2.2 體外抑菌實驗

1.2.2.1 濾紙片擴散法測定 抑菌圈直徑：將各受試菌于肉湯培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，調(diào)節(jié)菌懸液濃度為1×106CFU/mL。實驗分為青霉素對照組（2 g/L）、鏈霉素對照組（2 g/L）、黃芪水煎液組（1.0 g/mL）、酵母菌培養(yǎng)液組、黃芪發(fā)酵液低、中、高濃度組（0.1 g/mL，1.0 g/mL，2.5 g/mL）。用打孔器將普通定性濾紙打孔，制成直徑為6 mm的圓形紙片，121℃、0.15 MPa滅菌15 min，烘干備用。用移液器吸取50 μL各組藥液于無菌濾紙片上，反復吸收、干燥，制成含藥紙片，備用。吸取0.5 mL菌液均勻涂布于瓊脂平板上，將各組含藥濾紙片貼于培養(yǎng)基表面，置于恒溫培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)24 h，每組藥物平行重復5次實驗，用游標卡尺測量抑菌環(huán)直徑，取平均值［4-5］。

1.2.2.2 藥物最小抑菌濃度（MIC）的測定 采用試管二倍稀釋法［4，6］。取 10 支滅菌試管，依次編號，無菌操作。于每管先加入肉湯培養(yǎng)基2 mL，然后在1號試管中加入滅菌的黃芪發(fā)酵液（2.5 g/mL）2 mL，充分混勻后吸取2 mL放入2號試管，依次類推，藥液依次被稀釋為 1∶2，1∶4，1∶8……1∶256，即生藥含量為1.250 g/mL，0.625 g/mL，0.313 g/mL，0.156 g/mL，0.078 g/mL，0.039 g/mL，0.020 g/mL，0.010 g/mL，第 9 管不加藥液作為陽性對照，陰性對照管不加受試菌。將各受試菌接種于肉湯培養(yǎng)基中，37℃孵育8 h，用生理鹽水稀釋至1×10-3濃度，各菌株均取0.1 mL菌懸液，分別接種于含有不同濃度藥液的試管和陽性對照管中，混勻，于37℃培養(yǎng)24 h，觀察記錄結(jié)果。以濁度為指標判斷試管中是否有細菌生長。若肉湯渾濁，表示有細菌生長；若肉湯完全清亮，則無細菌生長。將無肉眼可見細菌生長的試管中的肉湯接種到營養(yǎng)瓊脂平板上，若仍無細菌生長，則該試管藥物濃度即為受試藥物的最低抑菌濃度（MIC）。

1.2.3 體內(nèi)抑菌實驗

1.2.3.1 體內(nèi)抑菌的預實驗 將低溫保藏的金黃色葡萄球菌試管斜面活化，接種于肉湯培養(yǎng)基，37℃過夜培養(yǎng)，過夜的肉湯培養(yǎng)物用肉湯作系列稀釋成1×103CFU/mL，1×104CFU/mL，1×105CFU/mL，1×106CFU/mL，1×107CFU/mL的菌懸液。取小鼠50只，體重18 g~22 g，雌雄各半，隨機分成5組，每組10只，將上述各濃度細菌懸液0.5 mL腹腔注射于小鼠，逐日觀察各組小鼠死亡情況，記錄3 d內(nèi)的死亡數(shù)，選定使小鼠死亡率達80%（LD80）的菌液濃度為正式實驗注射濃度。

1.2.3.2 體內(nèi)抑制金黃色葡萄球菌的實驗 18 g~22 g健康小鼠140只，隨機分為空白對照組、細菌對照組、黃芪水煎液組（1 g/mL）、黃芪發(fā)酵液低（0.1 g/mL）、中（1 g/mL）、高（2.5 g/mL）濃度組、陽性對照藥青霉素V鉀片（0.98 g/kg）組7組，每組20只，雌雄各半。各實驗組動物灌胃給予20 mL/kg相應藥液，空白對照組、細菌對照組灌胃給予等量蒸餾水，連續(xù)給藥7 d。將LD80金黃色葡萄球菌菌液0.5 mL/只腹腔注射感染小鼠，繼續(xù)給藥，記錄3 d內(nèi)小鼠死亡數(shù)，計算死亡率［7-8］。數(shù)據(jù)用SPSS13.0軟件處理分析，各濃度藥物與細菌對照組之間死亡率差異的比較采用χ2檢驗。

3 結(jié)果

3.1 對不同致病菌的抑制作用

結(jié)果見表1。

表1 濾紙片擴散法檢測黃芪酵母菌發(fā)酵液的抑菌活性 （抑菌圈直徑/mm）

由表1可知，陽性對照組青霉素對革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌和肺炎鏈球菌有較強的抑制作用；鏈霉素對革蘭氏陰性菌大腸桿菌、綠膿桿菌和普通變形桿菌有較強的抑制作用。黃芪發(fā)酵液對5種致病菌均有一定抑制作用，并且隨著濃度的升高，抑菌作用也逐漸增強。黃芪發(fā)酵液高濃度組對致病菌具有較強的抑制作用，與同濃度黃芪水煎液比較，抑菌圈直徑增大。但參比酵母菌培養(yǎng)液組各致病菌抑菌圈的大小，表明黃芪酵母菌發(fā)酵液抑菌作用的增強，不是由單純酵母菌自身代謝引起，而是酵母菌和黃芪共同作用的結(jié)果，推測可能是轉(zhuǎn)化成分所致。

3.2 對金黃色葡萄球菌引起小鼠死亡的影響

腹腔注射金黃色葡萄球菌的濃度為1×105CFU/mL時，小鼠死亡率為80%，因此本實驗采用濃度1×105CFU/mL為小鼠腹腔注射濃度。黃芪水煎液組、青霉素V鉀片以及黃芪酵母菌發(fā)酵液低、中、高濃度均能提高感染小鼠的存活數(shù)，與細菌對照組比較小鼠死亡率顯著降低（P<0.05，P<0.01），提示黃芪酵母菌發(fā)酵液有明顯的抗感染作用，對金黃色葡萄球菌感染小鼠具有明顯的保護作用。且黃芪發(fā)酵液組小鼠死亡率低于相同濃度黃芪水煎液組，與體外抑菌實驗抑菌圈測定結(jié)果一致。結(jié)果見表2。

3.3 不同菌株的MIC測定結(jié)果

表2 黃芪發(fā)酵液對金黃色葡萄球菌致小鼠死亡的保護作用

黃芪酵母菌發(fā)酵液對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、肺炎鏈球菌、綠膿桿菌、普通變形桿菌的MIC分別為 0.313 g/mL，0.078 g/mL，0.625 g/mL，0.313 g/mL，0.156 g/mL。結(jié)果見表3。

4 討論

黃芪的有效成分具有廣譜抗病毒、抗細菌、抗真菌作用，同時，可增強與調(diào)節(jié)機體的免疫系統(tǒng)功能［9］。但近年來，隨著黃芪用量的逐年增加，傳統(tǒng)使用方法對藥材的有效成分利用率較低，已不能滿足當前的用藥需求。中藥發(fā)酵技術(shù)是現(xiàn)代生物技術(shù)與傳統(tǒng)中醫(yī)藥研究的完美結(jié)合，已成為中藥現(xiàn)代化研究的新熱點。在發(fā)酵過程中，微生物可以中藥材為營養(yǎng)源進行生長、分裂、代謝和繁殖，利用其自身特有的強大酶系和代謝途徑，完成常規(guī)化學方法難以實現(xiàn)的生化反應；一些不能被人體直接利用的活性成分，通過生物轉(zhuǎn)化，被修飾后可直接被人體吸收利用，從而進一步提高了藥效。發(fā)酵后期的次生代謝產(chǎn)物有可能成為新的活性物質(zhì)，使中藥材產(chǎn)生新的預防、保健和治療功能［10］。

釀酒酵母本身無毒，且培養(yǎng)條件簡單，生長繁殖快，發(fā)酵能力強。因此，本研究以黃芪藥材為基質(zhì)進行酵母菌發(fā)酵，選取了臨床常見的5種致病菌，從體外和體內(nèi)兩個途徑考察了黃芪酵母菌發(fā)酵液對5種致病菌的抑制作用。濾紙片法測定致病菌抑菌圈直徑的平行重復試驗結(jié)果表明，酵母菌發(fā)酵液在體外對這些致病菌均有較好的抑制作用，并且抑菌作用隨濃度升高而增強。體內(nèi)實驗表明，黃芪酵母菌發(fā)酵液對金黃色葡萄球菌引起的小鼠感染有明顯的抗感染作用，體內(nèi)、體外抑菌效果均優(yōu)于同濃度的黃芪水煎液。推測可能是因為酵母菌在代謝過程中向胞外分泌蛋白酶、淀粉酶、纖維素酶、果膠酶等酶類進入到培養(yǎng)基，使黃芪細胞通透性增強、細胞間隙增加，從而使有效成分向胞外擴散的阻力減小而得以更多地釋放出來發(fā)揮抑菌作用［11］；或者酵母菌直接以黃芪成分為營養(yǎng)源，在發(fā)酵過程中產(chǎn)生了新的活性物質(zhì)，抑或?qū)o活性的底物轉(zhuǎn)化成了有活性的物質(zhì)。而且黃芪本身有調(diào)節(jié)機體免疫功能的作用，在體內(nèi)可能通過提高自身免疫力殺滅致病菌［12］。本研究證實發(fā)酵后黃芪抑菌作用增強，但究竟是哪些有效成分或部位發(fā)生了變化，或何種成分被修飾轉(zhuǎn)化，是否產(chǎn)生了新的活性成分，仍有待進一步研究。

表3 黃芪酵母菌發(fā)酵液的最小抑菌濃度

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