王正引 ，張小如 ，郭明章 ，全世建

（1.福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福建福州350122； 2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，廣東廣州510006；

3.福建中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，福建福州350122）

近年來(lái)已有研究報(bào)道，補(bǔ)益類方藥如枸杞［1］、右歸飲［2］對(duì)細(xì)胞凋亡有一定抑制作用，表明補(bǔ)益類方藥的作用機(jī)理可能與其干預(yù)細(xì)胞凋亡有關(guān)。中醫(yī)藏象理論認(rèn)為肝藏血，《素問(wèn)·五臟生成》曰“故人臥血?dú)w于肝，肝受血而能視?！备慰少A藏血液，調(diào)節(jié)血量，以濡養(yǎng)臟腑，維持機(jī)體功能的正常發(fā)揮。肝藏血不足是造成血虛證的主要原因之一。本研究基于肝藏血的理論，通過(guò)觀察補(bǔ)血養(yǎng)肝法對(duì)血虛證小鼠肝細(xì)胞凋亡的影響，希冀進(jìn)一步探討補(bǔ)血養(yǎng)肝法作用機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 C57BL/6J小鼠，清潔級(jí)，30只，雌雄各半，體重（20±2）g，上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供［動(dòng)物許可證號(hào)：SCK（滬）2012-0002］。

1.1.2 藥物及制備 補(bǔ)血養(yǎng)肝法的代表方選用四物湯，按《方劑學(xué)》［3］規(guī)定的劑量稱取，熟地 15 g，當(dāng)歸9 g，白芍9 g，川芎6 g，按傳統(tǒng)方法水煎，煎煮2次，取2次水煎液合并后濃縮成含生藥量約l g/mL，置4℃保存?zhèn)溆?。?shí)驗(yàn)時(shí)稀釋成25%。

1.1.3 試劑與儀器 注射用環(huán)磷酰胺（通化茂祥制藥有限公司，批號(hào)120801），TUNEL細(xì)胞凋亡原位檢測(cè)試劑盒（瑞士Roche公司），全自動(dòng)血液分析儀（日本Sysmex公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 分組 30只C57BL/6J小鼠隨機(jī)分為空白組、模型組、實(shí)驗(yàn)組3組，每組10只。

1.2.2 造模 小鼠常規(guī)飼養(yǎng)數(shù)天適應(yīng)環(huán)境后，參照化學(xué)損傷法［4］造模，模型組、實(shí)驗(yàn)組于實(shí)驗(yàn)第1天按小鼠體重0.1 g/kg腹腔注射環(huán)磷酰胺1次，空白組予等體積生理鹽水腹腔注射。

1.2.3 給藥實(shí)驗(yàn)組予四物湯5 g/（kg·d）灌胃，1次/d，連續(xù)灌胃7 d?？瞻捉M和模型組則給予等體積生理鹽水。

1.2.4 外周血象檢測(cè) 在實(shí)驗(yàn)第7天，給藥1 h后，每只小鼠眼眶后靜脈叢取血，檢測(cè)外周血紅細(xì)胞數(shù)、白細(xì)胞數(shù)、血小板數(shù)及血紅蛋白含量。

1.2.5 標(biāo)本采集及指標(biāo)檢測(cè) 在實(shí)驗(yàn)第8天，頸椎脫臼處死，剖腹取肝臟，4℃生理鹽水沖洗，濾紙吸干，肝右前葉切取1.0 cm×1.0 cm×1.0 cm組織塊，以10%甲醛固定，石蠟包埋，連續(xù)切片，以備用于原位末端標(biāo)記（TUNEL）法檢測(cè)細(xì)胞凋亡。按TUNEL細(xì)胞凋亡原位檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，用蛋白酶K室溫孵育30 min。磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗2次，滴加50 μL的TUNEL反應(yīng)混合溶液，在濕盒中37℃孵育60 min。PBS沖洗3次，加入50 μL轉(zhuǎn)化劑辣根過(guò)氧化物酶（POD），在濕盒中37℃孵育30 min。PBS沖洗3次，加入100 μL二氨基聯(lián)苯胺（DAB）底物溶液，室溫孵育10 min，PBS沖洗3次。蘇木素復(fù)染，封片。每張TUNEL切片選取5個(gè)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)最多的高倍鏡視野（×400），每個(gè)視野計(jì)算100個(gè)肝細(xì)胞，選取其中的陽(yáng)性細(xì)胞，計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)與總細(xì)胞數(shù)的百分比，即凋亡百分率。在光鏡下分析結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠外周血象比較

結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 各組小鼠外周血象比較 （±s）

表1 各組小鼠外周血象比較 （±s）

注：與模型組比較，1）P＜0.05

組別 n 紅細(xì)胞（1012/L）白細(xì)胞（109/L）血小板（109/L）血紅蛋白（g/L）空白組 109.84±0.691） 6.44±1.591） 1039.30±229.93149.90±10.401）模型組 107.51±0.734.67±1.251127.40±218.62120.30±10.06實(shí)驗(yàn)組 108.71±0.681） 6.28±1.991） 1238.80±298.23134.20±7.361）

由表1可見(jiàn)，與模型組相比，實(shí)驗(yàn)組外周血紅細(xì)胞計(jì)數(shù)、白細(xì)胞計(jì)數(shù)以及血紅蛋白含量均升高（P＜0.05），血小板計(jì)數(shù)各組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.2 肝細(xì)胞凋亡

經(jīng)TUNEL試劑盒染色，細(xì)胞核呈現(xiàn)出棕黃色或棕褐色染色的細(xì)胞為陽(yáng)性細(xì)胞，細(xì)胞核藍(lán)染的細(xì)胞是蘇木素復(fù)染的陰性細(xì)胞。

空白組肝細(xì)胞凋亡百分率為（17.60±7.15）%，模型組為（30.10±6.74）%，實(shí)驗(yàn)組為（17.80±5.61）%，模型組較空白組明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，實(shí)驗(yàn)組肝細(xì)胞凋亡百分率明顯降低（P＜0.05）。結(jié)果見(jiàn)圖1。

空白組

模型組

圖1 肝細(xì)胞凋亡圖

3 討論

對(duì)于補(bǔ)血方藥的補(bǔ)血作用機(jī)理的研究，近年來(lái)多數(shù)集中從免疫功能、骨髓造血功能等方面來(lái)探討。譚允育等［5］研究表明，四物湯可明顯改善60Co照射的血虛證模型小鼠的免疫功能，其中有顯著差異的包含了紅細(xì)胞抗體、溶血素、外周血B細(xì)胞、遲發(fā)型超敏反應(yīng)、T細(xì)胞數(shù)。薄華本等［6］研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)歸補(bǔ)血湯可能通過(guò)改善基質(zhì)細(xì)胞的狀態(tài)、增強(qiáng)骨髓細(xì)胞之間的黏附來(lái)改善骨髓造血微環(huán)境。吳宏忠等［7］研究表明，阿膠有效補(bǔ)血活性成分可升高紅、白細(xì)胞，其作用機(jī)制可能與保護(hù)貧血小鼠造血微環(huán)境和造血干、祖細(xì)胞，刺激髓外造血器官相關(guān)造血細(xì)胞因子表達(dá)有關(guān)。如前所述，補(bǔ)血方藥的作用機(jī)制之一，可能是通過(guò)增強(qiáng)細(xì)胞免疫功能，促進(jìn)骨髓造血，從而達(dá)到補(bǔ)血目的。

細(xì)胞凋亡是屬于受基因調(diào)控的程序性細(xì)胞死亡過(guò)程，對(duì)于機(jī)體器官功能正常發(fā)揮，保持自身穩(wěn)定發(fā)揮重要作用。因此對(duì)細(xì)胞凋亡干預(yù)機(jī)制的研究，已成為目前藥物研發(fā)的熱點(diǎn)。國(guó)內(nèi)已有學(xué)者從抑制細(xì)胞凋亡角度，探討補(bǔ)益類方藥的作用機(jī)理。杜江等［8］研究表明，龜鹿二仙膠可抑制模型大鼠軟骨細(xì)胞Bax的表達(dá)和促進(jìn)Bcl-2的表達(dá)，抑制去勢(shì)骨關(guān)節(jié)炎大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡。趙志明等［9］研究發(fā)現(xiàn)，何首烏飲可增加大鼠卵巢顆粒細(xì)胞內(nèi)凋亡抑制蛋白Bcl-2表達(dá)，減少凋亡促進(jìn)蛋白Bax表達(dá)，而發(fā)揮凋亡抑制作用。鄭鴻燕等［10］研究表明，當(dāng)歸補(bǔ)血湯對(duì)感音神經(jīng)性聾大鼠耳蝸干細(xì)胞移植后細(xì)胞凋亡有抑制作用。

四物湯是由《金匱要略》膠艾湯化裁而來(lái)。方中君藥熟地甘溫味厚，入肝、腎經(jīng)，長(zhǎng)于補(bǔ)血滋陰，填精益髓；臣藥當(dāng)歸甘辛溫，歸肝、心、脾經(jīng)，補(bǔ)血活血；佐以白芍酸甘微寒，入肝、脾經(jīng)，養(yǎng)血柔肝；川芎辛溫入肝、膽、心包經(jīng)，活血行氣。全方四味藥均入肝經(jīng)，可補(bǔ)血養(yǎng)肝，用于治療血虛證。因此本研究選用四物湯作為補(bǔ)血養(yǎng)肝法的代表方，從細(xì)胞凋亡的角度，探討該法補(bǔ)血作用機(jī)理。

本研究結(jié)果表明，補(bǔ)血養(yǎng)肝法可改善血虛證小鼠的外周血象，降低肝細(xì)胞凋亡百分率，提示補(bǔ)血養(yǎng)肝法作用機(jī)理可能與其減少肝細(xì)胞凋亡有關(guān)，但對(duì)于肝細(xì)胞凋亡的干預(yù)機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

［1］汪君民.枸杞對(duì)運(yùn)動(dòng)大鼠腎臟 Bcl-2、Bax表達(dá)和運(yùn)動(dòng)性蛋白尿的影響［J］.西安體育學(xué)院學(xué)報(bào)，2009，26（6）：719-724，730.

［2］陳瑜，沈自尹，陳偉華.補(bǔ)腎及健脾復(fù)方對(duì)皮質(zhì)酮大鼠T細(xì)胞凋亡信號(hào)相關(guān)基因群調(diào)控模式的對(duì)比研究［J］.中西醫(yī)結(jié)合學(xué)報(bào)，2004，2（5）：346-349.

［3］李冀.方劑學(xué)［M］.3版.北京：中國(guó)中醫(yī)藥出版社，2012：129.

［4］陳奇.中藥藥理研究方法學(xué)［M］.2版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2006：1169.

［5］譚允育，黃守雄，欒永紅，等.四物湯對(duì)60Co照射小鼠免疫功能影響的實(shí)驗(yàn)研究［J］.中國(guó)實(shí)驗(yàn)臨床免疫學(xué)雜志，1994，6（2）：40-43.

［6］薄華本，陳啟助，沈晗，等.當(dāng)歸補(bǔ)血湯調(diào)控骨髓造血機(jī)理及對(duì)造血微環(huán)境的影響［J］.中國(guó)新藥與臨床雜志，2013，32（10）：824-828.

［7］吳宏忠，楊帆，崔書(shū)亞，等.阿膠酶解成分對(duì)貧血小鼠造血系統(tǒng)的保護(hù)機(jī)制［J］.華東理工大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2008，34（1）：47-52.

［8］杜江，黃遠(yuǎn)鵬，李奕修，等.龜鹿二仙膠及其拆方對(duì)去勢(shì)骨關(guān)節(jié)炎大鼠關(guān)節(jié)軟骨中Bax和Bcl-2的影響［J］.中國(guó)中醫(yī)骨傷科雜志，2013，21（3）：4-7.

［9］趙志明，杜元杰，左一鵬，等.中藥何首烏飲對(duì)大鼠卵巢顆粒細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白bcl-2，bax表達(dá)的影響［J］.現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志，2012，21（23）：2530-2532，2564.

［10］鄭鴻燕，邰浩清，曾水林.當(dāng)歸補(bǔ)血湯對(duì)感音神經(jīng)性聾大鼠耳蝸干細(xì)胞移植后細(xì)胞凋亡的影響［J］.聽(tīng)力學(xué)及言語(yǔ)疾病雜志，2010，18（3）：271-274.