徐衛(wèi)東 錢元霞 曹 俊

江蘇大學(xué)藥學(xué)院1(212013) 南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院消化科2

鳥嘌呤核苷酸交換因子-H1(guanine nucleotide exchange factor-H1, GEF-H1)是Ren等[1]于1998年從人肝癌HeLa細(xì)胞cDNA文庫中篩選出來的Db1家族成員，其編碼分子質(zhì)量為100 kDa (1 Da=0.992 1 u)的蛋白，包含有C1(含有鋅指基序)、DH和PH(兩區(qū)域串聯(lián))、卷曲螺旋C末端等幾個區(qū)域，其中DH區(qū)域是與G蛋白主要作用的功能區(qū)。GEF-H1能刺激RhoA的鳥嘌呤核苷酸交換，研究表明其在多種腫瘤細(xì)胞中表達(dá)并可促進(jìn)細(xì)胞周期增殖，促進(jìn)細(xì)胞的運動和轉(zhuǎn)移等。本研究通過構(gòu)建人pEGFP-GEF-H1載體，并穩(wěn)定轉(zhuǎn)染結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞后檢測GEF-H1的表達(dá)水平，旨在為進(jìn)一步探討其在結(jié)腸癌發(fā)生、發(fā)展中的作用奠定基礎(chǔ)。

材料與方法

一、主要試劑和儀器

限制性內(nèi)切酶PacⅠ和T4DNA連接酶(New England Biolabs Inc.)，XhoⅠ、EcoRⅠ、BgLⅡ(Takara)，KOD-Plus-(TOYOBO)，質(zhì)粒小量提取試劑盒和無內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒(OMEGA)，T4DNA聚合酶和SAP(MBI Fermentas)，瓊脂糖凝膠回收試劑盒(Axygen)，DL2000(廣州東盛生物科技有限公司)，真核表達(dá)載體pEGFP-C1(BD公司)，大腸桿菌DH10B(Eppendorf公司)，結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞(中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細(xì)胞庫)，Trizol RNA提取試劑盒[寶生物工程(大連)有限公司]，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Neofectin(Mid Atlantic Biolabs, Inc)，RT-PCR試劑盒(Fermentas公司)，鼠抗人GEF-H1單克隆抗體(Abcam公司)，羊抗小鼠IgG-HRP(武漢博士德生物工程有限公司)，ECL超級發(fā)光液(碧云天生物技術(shù)研究所)。

TS100 Nikon倒置相差顯微鏡(Nikon公司)；Mini-PROTEAN 3電泳系統(tǒng)、Bio-RAD 525BR電泳儀(Bio-Rad公司)。

二、研究方法

1. 全基因合成人GEF-H1：XhoⅠ/EcoRⅠ克隆表達(dá)載體pEGFP-C1，pEGFP位于GEF-H1的N端，融合表達(dá)。根據(jù)GenBank的序列(AF486838)，使用在線合成引物設(shè)計軟件(http://helixweb.nih.gov/dnaworks)，合成引物，設(shè)計GEF-H1(1～160)的160條引物，行重疊PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 45 s，56 ℃ 45 s，72 ℃ 60 min，25個循環(huán)；72 ℃ 7 min，4 ℃ 3 min。

2. 目的片段的純化回收：瓊脂糖凝膠電泳分離PCR產(chǎn)物，DNA快速純化回收試劑盒回收目的片段，具體操作按產(chǎn)品說明書進(jìn)行。

3. 構(gòu)建人pEGFP-GEF-H1載體：利用基因中單一酶切位點BgLⅡ(AGATCT)，XhoⅠ/ BgLⅡ和BgLⅡ/EcoRⅠ分別雙酶切PCR回收產(chǎn)物GEF-H1-F1和GEF-H1-F2；XhoⅠ/EcoRⅠ雙酶切載體pEGFP-C1。按比例用T4連接酶連接，16 ℃ 16～20 h。

4. 感受態(tài)細(xì)菌的制備和轉(zhuǎn)化：電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌DH10B并擴(kuò)增，SOC培養(yǎng)基振蕩1 h后涂布于加有Kana(50 mg/L)的LB平板，37 ℃過夜。挑取單克隆，行菌落PCR驗證，GEF-H1引物上游：5’-CAG TCC TCG AGC CAT GTC TCG G-3’，下游：5’-GCG GTG ATC TCA GCT GAT TTC CAT TTC GAT CCC TCT GGC TA-3’，片段長度2 983 bp。篩選陽性克隆并擴(kuò)增，質(zhì)粒抽提試劑盒抽提，取10 μL質(zhì)粒送金斯瑞生物科技有限公司測序驗證。

5. 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞：取6孔培養(yǎng)板，每孔加入2 mL含對數(shù)生長期4×105個細(xì)胞的培養(yǎng)液，培養(yǎng)至70%～80%匯合時，行后續(xù)實驗。將結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞分為實驗組、空質(zhì)粒組，分別轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pEGFP-GEF-H1、空質(zhì)粒，以未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞作為空白對照。轉(zhuǎn)染24 h后，各孔加500 μg/mL G418行篩選，培養(yǎng)3 d后藥物濃度降至200 μg/mL，維持篩選至16 d，挑選G418抗性的細(xì)胞單克隆，單克隆長到相對較大的集落后，接種于24孔板。繼續(xù)培養(yǎng)，約4、5 d后即可消化傳代，轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶，熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞轉(zhuǎn)染情況。

6. RT-PCR鑒定GEF-H1 mRNA表達(dá)：按Trizol RNA提取試劑盒操作說明提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，行PCR擴(kuò)增。GEF-H1引物上游：5’-GAT GAA GGA AGC CAA GGA TG-3’，下游：5’-CCA GCA ATG TTG GTG GTA GA-3’，擴(kuò)增片段389 bp；以β-actin作為內(nèi)參，上游：5’-CGA GCG GGA AAT CGT GCG TGA CAT TAA GGA GA-3’，下游：5’-CGT CAT ACT CCT GCT TGC TGA TCC ACA TCT GC-3’，擴(kuò)增片段479 bp。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30個循環(huán)；72 ℃再延伸15 min。EB染色，PCR產(chǎn)物行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)觀察PCR產(chǎn)物的表達(dá)情況。

7. 蛋白質(zhì)印跡法鑒定GEF-H1蛋白表達(dá)：提取各組細(xì)胞總蛋白，蛋白定量后樣品按比例加入SDS凝膠上樣緩沖液溶解，煮沸5 min。以20 μg蛋白進(jìn)行上樣，電泳，然后將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜，封閉液封閉1 h，一抗(工作濃度1∶3 000)孵育4 ℃過夜，二抗(工作濃度1∶1 000)室溫孵育2 h，ECL發(fā)光液發(fā)光，暗室內(nèi)X線片感光、顯影、定影、觀察。

結(jié) 果

一、鑒定GEF-H1基因

重疊PCR擴(kuò)增結(jié)果顯示，利用基因中單一酶切位點BgLⅡ(AGATCT)，將GEF-H1分成兩段擴(kuò)增，即GEF-H1-F1和GEF-H1-F2，大小分別為1 350 bp和1 654 bp(圖1)。

M：DNA Marker；泳道1～3：GEF-H1-F1(1#-70#)；泳道4～6：GEF-H1-F2(71#-160#)

圖1GEF-H1PCR擴(kuò)增圖

二、鑒定pEGFP-GEF-H1載體中目的基因

以XhoⅠ/ BgLⅡ和BgLⅡ/EcoRⅠ分別雙酶切PCR回收產(chǎn)物GEF-H1-F1和GEF-H1-F2，XhoⅠ/EcoRⅠ雙酶切載體pEGFP-C1，基因大小分別為1 350 bp、1 654 bp和4 700 bp(圖2)。

M：DNA Marker；泳道1：GEF-H1-F1(1#-70#)；泳道2：GEF-H1-F2(71#-160#)；泳道3：pEGFP-C1

圖2pEGFP-GEF-H1質(zhì)粒行XhoⅠ/BgLⅡ和BgLⅡ/EcoRⅠ雙酶切鑒定(PCR法)

三、大腸桿菌的轉(zhuǎn)化和鑒定

挑取單克隆的轉(zhuǎn)化菌接種培養(yǎng)，PCR法特異性擴(kuò)增出2 983 bp的目的片段(圖3)，表明重組質(zhì)粒pEGFP-GEF-H1已轉(zhuǎn)入所鑒定的大腸桿菌中。

M：DNA Marker；泳道1～6: GEF-H1(1#-160#，2 983 bp)

圖3pEGFP-GEF-H1質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌的PCR檢測

四、pEGFP-GEF-H1質(zhì)粒測序

質(zhì)粒測序結(jié)果顯示序列正確。

五、熒光顯微鏡下HCT116細(xì)胞轉(zhuǎn)染情況

pEGFP-GEF-H1轉(zhuǎn)染HCT116細(xì)胞24 h后，熒光顯微鏡下可見綠色熒光蛋白表達(dá)(圖4)，表明重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞后能成功啟動基因EGFP的翻譯并表達(dá)有功能的綠色熒光蛋白，通過檢測綠色熒光蛋白的成功表達(dá)可間接確定pEGFP-GEF-H1成功轉(zhuǎn)染細(xì)胞。

六、RT-PCR檢測轉(zhuǎn)染HCT116細(xì)胞的GEF-H1 mRNA表達(dá)

經(jīng)凝膠電泳成像分析，轉(zhuǎn)染后的實驗組細(xì)胞GEF-H1 mRNA表達(dá)量與空白對照組和空質(zhì)粒組相比明顯升高(圖5)。

1：空白對照組；2：空質(zhì)粒組；3：實驗組

M：DNA Marker；泳道1：空白對照組；泳道2：空質(zhì)粒組；泳道3：實驗組

圖5pEGFP-GEF-H1轉(zhuǎn)染HCT116細(xì)胞后提高GEF-H1mRNA表達(dá)水平(PCR法)

七、蛋白質(zhì)印跡法檢測轉(zhuǎn)染HCT116細(xì)胞GEF-H1蛋白表達(dá)

實驗組HCT116細(xì)胞中GEF-H1蛋白表達(dá)較空質(zhì)粒組和空白對照組明顯升高(圖6)。

1：空白對照組；2：空質(zhì)粒組；3：實驗組

圖6pEGFP-GEF-H1轉(zhuǎn)染HCT116細(xì)胞后提高GEF-H1蛋白的表達(dá)水平(蛋白質(zhì)印跡法)

討 論

近年研究發(fā)現(xiàn)Rho蛋白與腫瘤發(fā)生、發(fā)展、浸潤、轉(zhuǎn)移等過程有密切的關(guān)系[2-4]，主要引起肌動蛋白細(xì)絲等細(xì)胞骨架蛋白重構(gòu)，從而維持細(xì)胞的形態(tài)極性，促進(jìn)細(xì)胞的變形趨化運動和游走[5]。此外，Rho家族成員參與對細(xì)胞周期的調(diào)控、細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)的調(diào)節(jié)等過程[6-7]，Rho家族鳥苷三磷酸酶(Rho GTPases)具有兩種形式：與GTP結(jié)合的活性形式和與GDP結(jié)合的非活性形式[8]。鳥苷酸交換因子(guanine nucleotide exchange factors, GEFs)可調(diào)節(jié)Rho GTPases蛋白的活性，促進(jìn)GDP轉(zhuǎn)換成GTP，因此可激活Rho GTPases，在白血病、p53突變型癌癥、上皮細(xì)胞紊亂、傳染病、心肌肥大等疾病中發(fā)揮重要作用，可調(diào)控細(xì)胞增殖、運動、侵襲、形態(tài)重要的骨架和信號組成蛋白[5,9-10]，因此GEF-H1基因可為癌癥治療提供新的靶點。本研究通過在線基因合成引物軟件設(shè)計人GEF-H1基因引物，PCR法回收目的片段，大腸桿菌轉(zhuǎn)化實驗得到重組質(zhì)粒pEGFP-GEF-H1，經(jīng)鑒定構(gòu)建成功。經(jīng)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞后，通過RT-PCR和蛋白質(zhì)印跡法發(fā)現(xiàn)GEF-H1高表達(dá)，表明轉(zhuǎn)染成功。結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移是影響患者療效和預(yù)后并導(dǎo)致死亡的重要因素，是當(dāng)前結(jié)直腸癌研究中最重要的方面，然而對于腫瘤細(xì)胞運動、侵襲和轉(zhuǎn)移的生物學(xué)機(jī)制仍不明確。本研究通過構(gòu)建高表達(dá)GEF-H1的結(jié)腸癌細(xì)胞株，旨在為進(jìn)一步探討結(jié)腸癌發(fā)生、浸潤和轉(zhuǎn)移與該基因的關(guān)系提供必要的實驗材料。

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