霍莉莉 李 慧 魏 楓 趙 華 任秀寶

乳腺癌中FoxP3表達(dá)與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的相關(guān)性及其意義*

霍莉莉 李 慧 魏 楓 趙 華 任秀寶

目的：探討乳腺癌組織FoxP3、TGF-β1的表達(dá)和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）的相互關(guān)系及其臨床意義。方法：免疫組織化學(xué)法檢測74例乳腺癌組織中FoxP3、TGF-β1、E-Cadherin、N-Cadherin、Vimentin和Fibronectin的表達(dá)情況，分析乳腺癌FoxP3蛋白表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系，以及FoxP3、TGF-β1的表達(dá)和EMT發(fā)生之間的關(guān)系。結(jié)果：FoxP3與TGF-β1的表達(dá)率和EMT的發(fā)生率分別為36.5%（27/74）、39.2%（29/74）和40.5%（30/74）。乳腺癌FoxP3表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)（P＜0.05），與其他臨床病理特征無關(guān)（P＞0.05）。FoxP3和TGF-β1的表達(dá)之間存在相關(guān)性，而TGF-β1可以促進EMT發(fā)生（P＜0.05）。結(jié)論：FoxP3的表達(dá)與乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和EMT的發(fā)生相關(guān)，可能作為預(yù)測乳腺癌轉(zhuǎn)移可能性的標(biāo)記物。

乳腺癌 FoxP3 TGF-β1 上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化

FoxP3是叉頭樣轉(zhuǎn)錄因子家族的成員之一，早期發(fā)現(xiàn)其特異性表達(dá)于CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，參與細(xì)胞發(fā)育和免疫抑制功能的發(fā)揮［1］。近年來發(fā)現(xiàn)，乳腺癌、胰腺癌、黑色素瘤等多種腫瘤細(xì)胞也有FoxP3的表達(dá)［2-4］。有研究認(rèn)為腫瘤細(xì)胞表達(dá)FoxP3能夠促進腫瘤發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，是腫瘤預(yù)后不良的獨立預(yù)測因素之一［5-8］。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）是具有極性的上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化成為具有移行能力的間質(zhì)細(xì)胞并獲得侵襲和遷移能力的過程，其在人胚胎干細(xì)胞分化過程中起著關(guān)鍵作用，在組織修復(fù)再生、器官纖維化和腫瘤發(fā)生時被重新激活［9］。目前普遍認(rèn)為EMT是腫瘤細(xì)胞發(fā)生侵襲與轉(zhuǎn)移的重要機制［10-12］。

本研究采用免疫組織化學(xué)方法檢測FoxP3蛋白和EMT標(biāo)志物在人乳腺癌組織中的表達(dá)水平，探討FoxP3和EMT之間是否存在相互聯(lián)系。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 患者資料 所有標(biāo)本均取自天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院乳腺外科2003年5月至2005年7月手術(shù)切除的浸潤性乳腺癌組織標(biāo)本，共74例，經(jīng)病理確診均為非特殊型浸潤性導(dǎo)管癌。患者均為女性，年齡分布27～69歲（中位年齡49歲）。手術(shù)前均未接受過抗癌治療（包括放療、化療及內(nèi)分泌治療等）。術(shù)后分期：Ⅰ期3例，ⅡA期26例，ⅡB期24例，ⅢA期8例，ⅢB期2例，ⅢC期10例，Ⅳ期1例。組織學(xué)分級：Ⅰ級4例，Ⅱ級49例，Ⅲ級21例。ER（+）14例，PR（+）12例，Her-2（+）45例。

1.1.2 主要試劑 鼠抗人FoxP3單克隆抗體（PCH101）購自美國eBioscience公司。兔抗人TGF-β1多克隆抗體購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。E-Cadherin、N-Cadherin、Vimentin、Fibronectin鼠抗人單克隆抗體購自美國BD公司。EnVision兩步法免疫組織化學(xué)檢測試劑購自福州邁新生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 免疫組化檢測乳腺癌組織中FoxP3、TGF-β1和EMT標(biāo)志物的表達(dá) 標(biāo)本經(jīng)10%中性甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，4 μm厚連續(xù)切片，常規(guī)HE染色及En-Vision法免疫組織化學(xué)染色。石蠟切片常規(guī)脫蠟水化，檸檬酸鈉緩沖液熱抗原修復(fù)，3%H2O2室溫孵育20 min阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性。滴加一抗，4℃孵育過夜。滴加酶標(biāo)記的二抗，濕盒室溫孵育30 min。DAB顯色，蘇木精對比染色。常規(guī)酒精梯度脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片。以PBS代替一抗做陰性對照。

1.2.2 陽性結(jié)果判斷 1）FoxP3以乳腺癌細(xì)胞細(xì)胞核中出現(xiàn)棕黃色或棕褐色顆粒為陽性表達(dá)，陽性細(xì)胞數(shù)≥25%為FoxP3表達(dá)陽性切片。2）TGF-β1以細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)黃色或棕黃色顆粒為陽性著色。結(jié)果采用半定量計分方法，陽性細(xì)胞數(shù)按無著色、陽性細(xì)胞數(shù)≤20%、21%～50%和＞50%分別判為0、1、2、3分，著色強度按無著色、黃色、棕黃色和棕褐色分別判為0、1、2、3分。兩項評分結(jié)果相乘＞6視為強陽性表達(dá)。3）EMT標(biāo)志物：①E-Cadherin以細(xì)胞膜出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性表達(dá)，陽性細(xì)胞數(shù)＞50%為陽性切片。②N-Cadherin以細(xì)胞膜和（或）細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性表達(dá)，陽性細(xì)胞數(shù)＞1%為陽性切片。③Vimentin以細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性表達(dá)，陽性細(xì)胞數(shù)＞1%為陽性切片。④Fibronectin以細(xì)胞膜出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性表達(dá)，陽性細(xì)胞數(shù)＞1%為陽性切片。其中E-Cadherin為上皮細(xì)胞標(biāo)志物，N-Cadherin、Vimentin和Fibronectin為間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物。上皮細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)陰性或者任一間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)陽性計為EMT陽性（+）。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)采用PASW Statistics 18.0統(tǒng)計軟件進行Mann-Whitney U檢驗、Kruskal-Wallis檢驗和χ2檢驗，用偏相關(guān)分析和二元Logistic回歸分析進行相關(guān)性分析，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 FoxP3和TGF-β1的表達(dá)情況

FoxP3在乳腺癌細(xì)胞最常見的表達(dá)部位為細(xì)胞質(zhì)，其次為細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核均表達(dá)，最少見的表達(dá)模式是僅細(xì)胞核表達(dá)?？紤]到FoxP3是轉(zhuǎn)錄因子，只有進入細(xì)胞核內(nèi)才能發(fā)揮作用，所以將胞核陽性作為FoxP3表達(dá)陽性的評價標(biāo)準(zhǔn)。在所有檢測的乳腺癌組織中，36.5%（27/74）的病例FoxP3蛋白表達(dá)陽性。39.2%（29/74）的病例高表達(dá)TGF-β1（圖1）。

2.2 乳腺癌組織FoxP3的表達(dá)與患者臨床病理特征的關(guān)系

比較乳腺癌實質(zhì)FoxP3蛋白表達(dá)與患者年齡、腫瘤大小、組織學(xué)分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、pTNM分期、ER、PR、Her-2的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)FoxP3的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)（P＜0.05），與其他指標(biāo)無關(guān)（P＞0.05，表1）。

2.3 EMT標(biāo)志物的表達(dá)情況

E-Cadherin主要表達(dá)于細(xì)胞膜，部分亦表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)。其陽性表達(dá)率為71.6%。N-Cadherin表達(dá)于細(xì)胞膜和（或）細(xì)胞質(zhì)，其陽性表達(dá)率為37.8%。Vimentin表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)，其陽性表達(dá)率為20.3%。Fibronectin表達(dá)于細(xì)胞膜，其陽性表達(dá)率為12.2%。根據(jù)EMT發(fā)生的判定標(biāo)準(zhǔn)，EMT陽性率為40.5%（圖1）。

2.4 乳腺癌中FoxP3、TGF-β1和EMT發(fā)生的相關(guān)情況

1）應(yīng)用二元Logistic回歸分析向后步進法分析FoxP3和TGF-β1與EMT的關(guān)系。以EMT為因變量Y（未發(fā)生=0，發(fā)生=1），以FoxP3和TGF-β1為自變量X，建立 Logistic回歸模型：Logit（p）=-0.901+1.249×TGF-β1。Logistic回歸模型似然比檢驗結(jié)果差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=6.481，df=1，P=0.011），回歸系數(shù)Wald χ2檢驗顯示P=0.013。優(yōu)勢比OR=3.487（1.308，9.297），95%CI上下限均＞1，因此可以認(rèn)為TGF-β1的表達(dá)可以誘導(dǎo)EMT發(fā)生。2）在控制EMT的條件下進行FoxP3與TGF-β1的偏相關(guān)分析，發(fā)現(xiàn)兩者之間存在相關(guān)性（P＜0.001）?？蓳?jù)此認(rèn)為在消除EMT影響的條件下，乳腺癌FoxP3與TGF-β1的表達(dá)間存在相關(guān)性。

圖1 免疫組織化學(xué)檢測FoxP3、TGF-β1和EMT標(biāo)志物的表達(dá) （SP×400）Figure 1 Immunohistochemical staining detected the expression of FoxP3,TGF-β1 and markers of EMT （SP×400）

表1 乳腺癌組織FoxP3的表達(dá)與患者臨床病理特征的關(guān)系Table 1 Correlation between expression of FoxP3 and clinicopathologic features of breast carcinoma

3 討論

FoxP3是影響CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞發(fā)育的一個關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，并且能維持其免疫抑制功能，一直被認(rèn)為是CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的特異性標(biāo)志［13］。之后研究發(fā)現(xiàn)FoxP3在部分CD4+CD25-T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞也有表達(dá)［14］，而近年來研究證實FoxP3在多種人正常上皮細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞亦有表達(dá)，影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展以及腫瘤細(xì)胞與腫瘤微環(huán)境之間的相互作用。胰腺癌和黑色素瘤細(xì)胞異常表達(dá)FoxP3，在共培養(yǎng)條件下能夠抑制初始CD4+CD25-T細(xì)胞的增殖，促進腫瘤細(xì)胞免疫逃逸［2，15］。

本研究結(jié)果顯示，在74例檢測的乳腺癌組織中，36.5%的病例FoxP3蛋白表達(dá)陽性，并且乳腺癌組織表達(dá)FoxP3與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)（P＜0.05），提示FoxP3可能在腫瘤的進展和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮作用。Merlo等［8］發(fā)現(xiàn)乳腺癌表達(dá)FoxP3能夠作為發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移風(fēng)險的預(yù)測因素。同時，本研究也發(fā)現(xiàn)FoxP3的表達(dá)與轉(zhuǎn)化生長因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）的表達(dá)以及EMT相關(guān)，提示其可能通過調(diào)節(jié)TGF-β1而影響EMT，從而影響腫瘤的進展。

上皮細(xì)胞在EMT過程中發(fā)生一系列生物學(xué)改變，如細(xì)胞極性消失、喪失細(xì)胞間連接、細(xì)胞游走或散在分布以及重新表達(dá)間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物等，從而轉(zhuǎn)化為具有間質(zhì)特點的間質(zhì)樣細(xì)胞［9］。EMT不僅存在于胚胎發(fā)育和組織分化過程中，同時也參與組織修復(fù)、器官纖維化以及腫瘤的浸潤轉(zhuǎn)移［9］。EMT能夠賦予細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移能力、誘導(dǎo)干細(xì)胞特性、阻止自身凋亡和衰老以及誘發(fā)免疫抑制等［9］，這些特性對于腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移至關(guān)重要，因此近年來EMT的誘發(fā)因素及其與腫瘤微環(huán)境之間的相互作用一直是研究熱點。轉(zhuǎn)化生長因子-β、成纖維細(xì)胞生長因子、表皮生長因子、基質(zhì)金屬蛋白酶等都可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生EMT，而其中研究時間最久、機制闡釋最為透徹的就是TGF-β1［16-19］。在體外培養(yǎng)條件下外源添加TGF-β1能夠誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞系發(fā)生EMT［20］，而近年來研究認(rèn)為細(xì)胞自分泌TGF-β1在誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生EMT中發(fā)揮作用，同時也參與細(xì)胞經(jīng)歷EMT后的間質(zhì)細(xì)胞樣狀態(tài)的維持［21-22］。Zuo等［3］報道乳腺癌細(xì)胞表達(dá)FoxP3。有文獻報道用siRNA抑制黑色素瘤細(xì)胞表達(dá)FoxP3能夠下調(diào)TGF-β1的表達(dá)；反之，過表達(dá)FoxP3能夠上調(diào)TGF-β1的表達(dá)［15］。即腫瘤細(xì)胞可以通過FoxP3上調(diào)TGF-β1的表達(dá)，從而影響EMT作用進而促進腫瘤的進展和轉(zhuǎn)移。

本實驗發(fā)現(xiàn)乳腺癌細(xì)胞FoxP3的表達(dá)和TGF-β1的高表達(dá)之間存在相關(guān)性，而且TGF-β1與EMT發(fā)生相關(guān)（P＜0.05）。推測乳腺癌細(xì)胞可能通過FoxP3調(diào)節(jié)TGF-β1表達(dá)，而TGF-β1通過自分泌的形式參與乳腺癌細(xì)胞EMT的發(fā)生與維持過程。近期研究表明，F(xiàn)oxP3可以控制多種與TGF-β信號通路和EMT相關(guān)的基因表達(dá)，進一步支持了本文的結(jié)論［23］。

雖然隨著治療方法的不斷改進，乳腺癌的生存率得到了極大地提高，但是腫瘤轉(zhuǎn)移仍然是威脅患者生存的重要原因。本結(jié)果顯示FoxP3在乳腺癌轉(zhuǎn)移中扮演重要角色，有可能是新的分子標(biāo)志物，成為免疫治療的新靶點。

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（2013-07-13收稿）

（2013-08-24修回）

Clinical significance of FoxP3 and the correlation of FoxP3 expression with epithelial-mesenchymal transition in breast cancer

Lili HUO1,2,3,Hui LI1,2,3,Feng WEI1,2,3,Hua ZHAO1,2,3,Xiubao REN1,2,3

Xiubao REN;E-mail:rwziyi@yahoo.com
1Department of Immunology,Tianjin Medical University Cancer Institute and Hospital,2National Clinical Research Center of Cancer,and3Key Laboratory of Cancer Immunology and Biotherapy,Tianjin,Tianjin 300060,China.

Objective:This study aims to investigate the correlation between the expression of FoxP3,TGF-β1,and epithelial-mesenchymal transition(EMT)in breast cancer and to determine the clinical significance of FoxP3.Methods:The expression of FoxP3,TGF-β1,E-Cadherin,N-Cadherin,Vimentin,and Fibronectin protein were detected in the cancer cells of 74 cases with breast carcinoma via immunohistochemistry.The correlation of FoxP3 protein with clinico-pathologic features of breast carcinoma and the relationships among the expressions of FoxP3,TGF-β1,and epithelial-mesenchymal transition(EMT)were analyzed.Results:The expression rates of FoxP3,TGF-β1,and EMT are 36.5%(27/74),39.2%(29/74),and 40.5%(30/74),respectively.The FoxP3 protein expression in breast cancer is correlated with lymph node metastasis(P＜0.05)but not with other clinico-pathological features(P＞0.05).The expression of FoxP3 is also correlated with the expression of TGF-β1.Furthermore,TGF-β1 can induce EMT(P＜0.05).Conclusion:The expression of FoxP3 is correlated with lymph node metastasis and EMT in breast cancer.Therefore,FoxP3 may be a marker for predicting metastasis.

breast cancer,FoxP3,TGF-β1,epithelial-mesenchymal transition

10.3969/j.issn.1000-8179.20131533

天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院免疫室，國家腫瘤臨床醫(yī)學(xué)研究中心，天津市腫瘤免疫與生物治療重點實驗室（天津市300060）

*本文課題受國家自然科學(xué)基金（編號：81171983）、天津市應(yīng)用基礎(chǔ)及前沿技術(shù)研究計劃（編號：12JCYBJC16100）和國家重點基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃“973”項目（編號：2012CB9333004）資助

任秀寶 rwziyi@yahoo.com

This work was supported by the National Natural Science Foundation of China(No.81171983),Tianjin Research Projects for Application Foundation and cutting-edge Technologies(No.12JCYBJC16100)and the National"973"Program of China(No.2012CB9333004).

（本文編輯：賈樹明）

霍莉莉 碩士生在讀，主要研究方向為腫瘤免疫在腫瘤轉(zhuǎn)移中的作用機制。

E-mail：shanping.li@aliyun.com