姚文健 白 玉 趙寶生

(新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院胸外科，河南 衛(wèi)輝 453100)

我國(guó)食管癌5年生存率不足10%〔1〕。影響食管癌患者術(shù)后長(zhǎng)期生存的主要問(wèn)題是腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移〔2〕。因此，探索食管癌轉(zhuǎn)移的抑制方法具有重要的研究意義。腫瘤的過(guò)繼性免疫治療是腫瘤治療的一個(gè)全新領(lǐng)域〔3〕。細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷(CIK)細(xì)胞是一種新型、高效、廣譜殺瘤的免疫活性細(xì)胞。輸注CIK細(xì)胞的過(guò)繼性免疫療法已經(jīng)成為手術(shù)、放療、化療后一種重要的輔助手段，它對(duì)于防止腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移具有重要的意義〔4〕。本文分析三種來(lái)源CIK細(xì)胞對(duì)人食管癌裸鼠原位移植瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的抑制作用。

1 材料與方法

1.1材料 臍血為新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科提供，均系健康產(chǎn)婦正常分娩的臍帶血；健康人外周血采自本院志愿者；食管癌患者的外周血由本院食管癌患者提供。BALB/C裸鼠由新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，3～4周齡，體重16～22 g，雌雄均可。裸鼠在恒溫25～27℃、恒濕40%～50%、無(wú)特殊病原菌(SPF)級(jí)飼養(yǎng)室條件下飼養(yǎng)。

1.2試劑及儀器 基因重組人白細(xì)胞介素(rhIL)-2(上海華新生物高科技術(shù)有限公司)；基因重組人干擾素γ(rhIFN-γ)、CD3 單克隆抗體(McAb)(美國(guó)Cytolab公司)；基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-9抗體(北京中杉金橋公司)；其他常用試劑及儀器由新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院干細(xì)胞與再生醫(yī)學(xué)研究中心提供。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1CIK細(xì)胞的制備 參照美國(guó)斯坦福大學(xué)CIK細(xì)胞培養(yǎng)方法〔5〕。外周血經(jīng)血細(xì)胞分離機(jī)采集，經(jīng)Ficoll液梯度離心分離單個(gè)核細(xì)胞，按照細(xì)胞濃度2×106/ml混懸在無(wú)血清培養(yǎng)液中。CIK細(xì)胞的誘導(dǎo)：第0天向培養(yǎng)袋中以2 000 U/ml加入rhIFN-γ；置37℃、5%CO2孵箱中孵育。1 d后向培養(yǎng)袋中以1 000 U/ml加入rhIL-2；以50 ng/ml加入CD3MAb；置37℃、5%CO2孵箱中孵育。然后每2～3 d半量換液并補(bǔ)加細(xì)胞因子rhIL-2和CD3Mab。培養(yǎng)14 d，即獲得CIK細(xì)胞。

1.3.2裸鼠原位移植模型的建立 選擇低分化、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽(yáng)性食管癌組織，標(biāo)本離體后在去除周?chē)睦w維組織及壞死部分，用含有青霉素/鏈霉素雙抗(終濃度為100 IU/ml)及10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液反復(fù)沖洗后，用彎剪剪成約1 mm3組織碎塊。裸鼠經(jīng)0.5%戊巴比妥鈉(30 mg/kg)腹腔注射全麻。取2粒組織碎塊包埋于裸鼠右腹部皮下繼續(xù)飼養(yǎng)。成瘤后連續(xù)鼠間傳代，取傳3代后的瘤塊作為裸小鼠的原位移植瘤塊。裸鼠全麻后取腹正中線切口開(kāi)腹，在手術(shù)顯微鏡下游離食管下段。做3 mm切口深達(dá)黏膜下層，經(jīng)切口將2粒1 mm3瘤塊以10/0無(wú)損傷縫合線固定于食管壁黏膜下層。以7/0絲線縫合腹膜，5/0絲線縫皮，繼續(xù)飼養(yǎng)。

1.3.3動(dòng)物實(shí)驗(yàn) 取32只原位移植術(shù)后荷瘤裸鼠，隨機(jī)分為：食管癌患者自體外周血CIK細(xì)胞組、健康人外周血CIK細(xì)胞組、臍血CIK細(xì)胞組及生理鹽水對(duì)照組，每組8只。移植后72 h經(jīng)尾靜脈給藥，對(duì)照組注射生理鹽水，各治療組注射CIK細(xì)胞(2×1010/ml)，每天1次，每次0.3 ml，連續(xù)20 d。停藥后72 h處死裸鼠。解剖測(cè)量瘤重，計(jì)算抑瘤率。抑瘤率=(1-治療組平均移植瘤重/生理鹽水對(duì)照組平均移植瘤重)×100%。觀察淋巴結(jié)及內(nèi)臟轉(zhuǎn)移情況。

1.3.4免疫組織化學(xué)染色 采用免疫組化SP法，對(duì)各組腫瘤組織應(yīng)用MMP-9抗體進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。按陽(yáng)性細(xì)胞占所觀察細(xì)胞的百分率及著色強(qiáng)度綜合計(jì)分行半定量分析?；静恢哂?jì)為0分；著色淡黃色者計(jì)為1分；棕黃色者計(jì)為2分；棕褐色者計(jì)為3分。無(wú)陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)為0分，陽(yáng)性細(xì)胞≤10%計(jì)為1分，陽(yáng)性細(xì)胞11%～50%計(jì)為2分，陽(yáng)性細(xì)胞51%～75%計(jì)為3分，陽(yáng)性細(xì)胞>75%計(jì)為4分。染色強(qiáng)度與陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)分乘積0～2分記為(-)，3～5分為(+)，6～9分為()，10分～12分為()。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)和Fisher分析。

2 結(jié) 果

2.1各組移植瘤瘤重及抑瘤率 與對(duì)照組相比，CIK細(xì)胞治療組的原位移植瘤重量明顯減輕，且臍血CIK細(xì)胞組的瘤重明顯低于另外二種來(lái)源的CIK細(xì)胞組(P<0.05)。而且其抑瘤率，明顯高于健康人外周血CIK細(xì)胞組及食管癌患者自體外周血CIK細(xì)胞組(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 三種來(lái)源CIK細(xì)胞對(duì)人食管癌裸鼠原位移植瘤的抑制作用(n=8，±s)

2.2各組移植瘤的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移情況 裸鼠解剖發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組裸鼠食管腫瘤發(fā)生多發(fā)轉(zhuǎn)移，轉(zhuǎn)移多見(jiàn)于下段食管旁淋巴結(jié)、下肺韌帶淋巴結(jié)、胃周淋巴結(jié)及肝、肺。與生理鹽水對(duì)照組相比，CIK細(xì)胞治療組的腫瘤轉(zhuǎn)移明顯被抑制(P<0.05)。臍血CIK細(xì)胞組的轉(zhuǎn)移率明顯低于另外二種來(lái)源的CIK細(xì)胞組(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 各組裸小鼠移植腫瘤的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移情況(n，n=8)

2.3免疫組織化學(xué)染色檢察 免疫組織化學(xué)染色可見(jiàn)對(duì)照組腫瘤組織中大量細(xì)胞MMP-9陽(yáng)性表達(dá)；各治療組腫瘤組織中MMP-9陽(yáng)性細(xì)胞均明顯減少(P<0.05)。見(jiàn)表3、圖1。

表3 人食管癌裸鼠原位移植模型腫瘤組織中MMP-9的表達(dá)情況(n，n=8)

生理鹽水對(duì)照組 臍血CIK細(xì)胞組

3 討 論

中國(guó)是食管癌病死率最高的國(guó)家。一直以來(lái)，國(guó)內(nèi)多采用食管癌術(shù)后輔助放、化療的治療方法，但這會(huì)引起消化道反應(yīng)、抑制骨髓造血、降低患者免疫力等諸多不良反應(yīng)〔6〕。現(xiàn)在許多學(xué)者開(kāi)始積極探索生物治療、基因靶向治療等新途徑。用免疫活性細(xì)胞輸注的過(guò)繼免疫療法是腫瘤生物治療的研究熱點(diǎn)之一，此療法不僅是常規(guī)抗腫瘤治療的補(bǔ)充，更為晚期不宜手術(shù)或無(wú)法承受放療、化療不良反應(yīng)的患者開(kāi)辟了新的治療途徑〔7〕。CIK細(xì)胞是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一種新型抗腫瘤細(xì)胞，其主要效應(yīng)細(xì)胞表面既有T細(xì)胞的表面標(biāo)志CD3，也有自然殺傷細(xì)胞的表面標(biāo)志CD56，因而兼有T細(xì)胞的抗腫瘤活性和自然殺傷細(xì)胞的非主要組織相容性復(fù)合物(MHC)限制性殺傷腫瘤細(xì)胞的特點(diǎn)〔8〕。CIK細(xì)胞可由外周血及臍血的單個(gè)核細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)而成，但目前對(duì)不同來(lái)源CIK的比較研究較少。本研究分別將食管癌患者自身外周血、健康人外周血、臍血三種來(lái)源的CIK細(xì)胞輸注于荷瘤裸鼠，顯示CIK細(xì)胞治療組能明顯抑制食管癌移植瘤的生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移，且臍血CIK細(xì)胞組抑制作用最強(qiáng)。

腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移是一個(gè)多因素、多步驟的生物學(xué)過(guò)程。在腫瘤轉(zhuǎn)移過(guò)程中，MMPs家族在促進(jìn)腫瘤細(xì)胞遷移、細(xì)胞外基質(zhì)降解和腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為中過(guò)程中發(fā)揮了關(guān)鍵作用，尤其是MMP-9被認(rèn)為不僅可降解細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，還可調(diào)控血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)，與腫瘤新生血管形成相關(guān)，從而在腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用〔9〕。已有研究指出，MMP-9的表達(dá)與食管癌的轉(zhuǎn)移和侵襲有關(guān)〔10〕。而在本研究中，我們也觀察到CIK細(xì)胞能下調(diào)裸鼠食管癌移植瘤中MMP-9的表達(dá)。因此，可以認(rèn)為在CIK細(xì)胞抑制食管癌轉(zhuǎn)移的過(guò)程中，抑制MMP-9的表達(dá)可能是其重要途徑。

綜上，CIK細(xì)胞具有一定的抑制腫瘤生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移的作用，其機(jī)制可能與降低腫瘤組織MMP-9表達(dá)有關(guān)。輸注CIK細(xì)胞有望成為新的食管癌治療方法。

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