于學(xué)燕

(山東省胸科醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，山東 濟(jì)南 250013)

肺癌患者常因癌腫轉(zhuǎn)移或惡性侵襲而死亡，因此，如何減少肺癌惡性侵襲與癌腫的轉(zhuǎn)移成為臨床診治肺癌的研究熱點〔1〕。上皮型E-鈣黏蛋白(E-cadherin)在腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移中起著重要作用〔2〕。Bcl-2/腺病毒E1B19 kD結(jié)合蛋白3(BNIP3)則通過促進(jìn)線粒體水腫，影響腫瘤細(xì)胞能量代謝等線粒體途徑，從而促進(jìn)腫瘤組織的凋亡〔3〕。缺氧誘導(dǎo)因子(HIF)-1α可在缺氧的環(huán)境中導(dǎo)致葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白1、血管內(nèi)皮因子、促紅細(xì)胞生成素與碳酸酐酶9等基因的表達(dá)降低〔4〕。本研究利用免疫組化法與RT-PCR檢測方法，檢測E-cadherin、BNIP3、HIF-1α在老年肺癌組織中的表達(dá)與臨床意義。

1 資料與方法

1.1材料 75例肺癌組織采集于山東省胸科醫(yī)院腫瘤內(nèi)科2010年1月至2013年8月住院患者存取的肺癌組織蠟塊，全部患者符合肺癌的臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)，按世界衛(wèi)生組織(WHO)老年人劃分的新標(biāo)準(zhǔn)〔5〕為>60歲的高齡患者〔6〕。排除標(biāo)準(zhǔn)〔6〕：曾行免疫治療、化療與放療，具有手術(shù)禁忌證的患者。男57例，女 18例，其中小細(xì)胞癌13例，腺癌25例，支氣管肺癌14例，鱗癌23例；無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移28例，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移47例；Ⅰ期33例，Ⅱ期32例，Ⅲ期8例，Ⅳ期2例。45例正常肺組織采集于癌旁遠(yuǎn)處正常肺部組織并存檔蠟塊；8%～10%甲醛固定，石蠟，蘇木精-伊紅(HE)染色劑。

1.2試劑 免疫組化試劑盒，抗體，磷酸鹽緩沖液(PBS)配方，RT-PCR反應(yīng)體系包括12.5 μl Master Mix(dNTP、DNA Polymerase、 緩沖液等試劑混合物)、0.4 μl上游引物、0.4 μl下游引物、10.7 μl去離子水、1 μl 模板；2%瓊脂糖凝膠。

1.3檢測方法

1.3.1免疫組化方法 (1)E-cadherin蛋白檢測：免疫組化試劑盒由Zymed公司提供,1%鼠抗人E-cadherin 抗體均由Zymed公司提供，嚴(yán)格按照試劑盒的操作規(guī)范，進(jìn)行E-cadherin蛋白表達(dá)情況的測定；(2)BNIP3蛋白測定：BNIP3兔多克隆抗體由英國Abcam公司提供,切片脫水后進(jìn)行微波加熱修復(fù)，放進(jìn)pH6的緩沖液中，蓋上小孔蓋子，微波加熱直至沸騰，加熱修復(fù)液10～15 min，室溫下冷卻30 min后滴加PBS配方，室溫下放置20 min，PBS配方再次進(jìn)行緩慢沖洗3次，約2 min/次，HE染色，樹膠固定，陽性切片作為肺癌組，PBS緩沖液配方作為單抗正常肺組織組。(3)2%兔抗人HIF-1α抗體由中國柏世德公司提供，嚴(yán)格按照試劑盒說明進(jìn)行操作，PBS緩沖液作為陰性正常肺組織組。

1.3.2RT-PCR方法 通過RT-PCR方法進(jìn)行E-cadherin 、BNIP3、HIF-1α mRNA檢測，標(biāo)本速凍后冷存于-80℃中，按照TRIZOL試劑盒說明提取總mRNA，按照FRTS試劑盒說明進(jìn)行cDNA轉(zhuǎn)錄合成操作，按照Primer 6.0設(shè)計PCR引物序列，在72℃～95℃中進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)，常規(guī)瓊脂凝膠電泳分析，用Kodark 1D成像系統(tǒng)進(jìn)行凝膠成像掃描，以β-actin作為對照。

1.4觀察指標(biāo)

1.4.1蛋白表達(dá)評定 根據(jù)細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核呈現(xiàn)黃色作為陽性細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)，觀察并記錄陽性細(xì)胞率與顯色強度，每張切片在400倍鏡中隨機采集5個視野，統(tǒng)計陽性細(xì)胞與癌腫細(xì)胞的比率作為陽性細(xì)胞率，按照陽性細(xì)胞率的大小進(jìn)行0～4分的評分。根據(jù)染色程度進(jìn)行顯色強度的評分。①陽性細(xì)胞率的評分標(biāo)準(zhǔn)：0分(0～5%)、1分(6%～25%)、2分(26%～50%)、3分(51%～75%)、4分(76%～100%)；②顯色強度評分標(biāo)準(zhǔn)：0分(染色與陰性組相同)、1分(淡黃色)、2分(接近深褐色)、3分(深褐色)。陽性細(xì)胞率與染色強度乘積作為免疫組化評分，評分在3分以上為陽性病例；由兩名病理醫(yī)生進(jìn)行蛋白表達(dá)的評定。

1.4.2E-cadherin、BNIP3、HIF-1α蛋白表達(dá)相關(guān)性評價 根據(jù)高表達(dá)和低表達(dá)的分類標(biāo)準(zhǔn)〔5〕：免疫組化經(jīng)兩名病理醫(yī)生看過后均評為8分及其以上為高表達(dá)，評分在3～7分為低表達(dá)。

1.5統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS17.0軟件進(jìn)行分析，計量資料采用t檢驗，計數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗，相關(guān)分析采用Spearman檢驗。

2 結(jié) 果

2.1E-cadherin、BNIP3、HIF-1α蛋白表達(dá) 肺癌組E-cadherin陽性表達(dá)率(62.67%，47例)顯著低于正常肺組織組(100.00%，45例)；肺癌組BNIP3、 HIF-1α陽性表達(dá)率(68.00%，51例；53.33%，40例)顯著高于正常肺組織組(均為6.67%，5例)(均P<0.05)。

2.2E-cadherin、BNIP3、HIF-1α mRNA表達(dá) 肺癌組織E-cadherin密度比值(1.51±0.38)顯著低于正常肺組織(3.16±0.51)，肺癌組織BNIP3、HIF-1α密度比值(1.48±0.37，1.19±0.29)顯著高于正常肺組織(0.21±0.04，0.22±0.05)(P<0.05)。見圖1。

A:肺癌組織;B:正常組織

2.3E-cadherin、BNIP3、HIF-1α蛋白表達(dá)的相關(guān)性 E-cadherin和BNIP3表達(dá)陽性率在肺癌組織中呈負(fù)相關(guān)(r=-0.37,P<0.05)；E-cadherin陽性率在肺癌組織中蛋白陽性表達(dá)率中呈負(fù)相關(guān)(r=-0.39,P<0.05)；BNIP3與HIF-1α表達(dá)陽性率在肺癌組織中陽性率呈正相關(guān)(r=0.41，P<0.05)。見表1。

表1 E-cadherin、BNIP3、HIF-1α蛋白表達(dá)的相關(guān)性(n)

2.4E-cadherin、BNIP3、HIF-1α表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系 E-cadherin的表達(dá)與肺癌的分化程度、臨床分期、淋巴轉(zhuǎn)移與組織學(xué)類型相關(guān)，主要表現(xiàn)為高分化、Ⅰ～Ⅱ型、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與支氣管肺癌的陽性表達(dá)率越高；BNIP3的表達(dá)與肺癌的分化程度、臨床分期、淋巴轉(zhuǎn)移與組織學(xué)類型等臨床病理因素均無關(guān)系；HIF-1α其中陽性與分化程度、臨床分期與組織學(xué)類型相關(guān)，主要表現(xiàn)為低分化、Ⅲ～Ⅳ期、鱗癌的HIF-1α的陽性表達(dá)率越高。見表2。

表2 E-cadherin、BNIP3、HIF-1α表達(dá)陽性率與臨床病理特征的關(guān)系〔n(%)〕

3 討 論

目前，肺癌的發(fā)生和轉(zhuǎn)移機制尚未完全明確，以致肺癌的臨床療效及預(yù)后均不理想。尤其對于老年患者來說，相關(guān)研究更為少見；腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移是影響肺癌臨床療效及預(yù)后的重要因素之一〔7〕。在對其他腫瘤的研究中發(fā)現(xiàn)腫瘤可形成間質(zhì)性的浸潤，造成細(xì)胞黏附力的減弱，惡性腫瘤細(xì)胞通過血管與淋巴結(jié)進(jìn)行全身各器官的轉(zhuǎn)移。E-cadherin是細(xì)胞黏附分子家族的成員，研究〔8〕表明，E-cadherin表達(dá)下降可造成細(xì)胞與細(xì)胞之間的黏附力下降，加速惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移速度。BNIP3則是能與Bcl-2、E1B19k相結(jié)合的蛋白，定位與線粒體上，HIF-1α可使BNIP3呈現(xiàn)高表達(dá)，兩者共同作用下可使缺氧環(huán)境下的靶基因呈現(xiàn)更高表達(dá)。BNIP3的過表達(dá)可降低線粒體的功能導(dǎo)致正常細(xì)胞的死亡〔9〕；研究〔10〕表明，BNIP3通過降低抗凋亡蛋白的作用并以游離的狀態(tài)下自身激活增加線粒體的通透性，增加誘導(dǎo)凋亡因子的釋放造成正常細(xì)胞的死亡。多種研究〔11〕表明，BNIP3與HIF-1α的表達(dá)呈正相關(guān)，并在各種惡性腫瘤組織中呈現(xiàn)高表達(dá)。腫瘤組織必須抵抗缺氧微環(huán)境下不利于生存的環(huán)境，適應(yīng)缺氧環(huán)境后可誘導(dǎo)新生血管的產(chǎn)生〔12〕，HIF-1α在缺氧環(huán)境下可存在一種轉(zhuǎn)錄因子，檢測腫瘤組織的HIF-1α可預(yù)測腫瘤微環(huán)境下的缺氧情況，另外，HIF-1α具有對各種血細(xì)胞生成素表達(dá)的調(diào)控作用，在惡性腫瘤的增殖、轉(zhuǎn)移與癌腫的血液支持中起著重要的作用，研究〔13〕證明：多種癌癥組織中均存在HIF-1α的高表達(dá)情況，可預(yù)測HIF-1α的表達(dá)與癌癥患者的預(yù)后關(guān)系密切。

E-cadherin、HIF-1α表達(dá)均與組織學(xué)類型、臨床分期等臨床病理因素密切相關(guān)，在肺癌組織中，E-cadherin呈低表達(dá)，BNIP3與HIF-1α呈高表達(dá)，E-cadherin與BNIP3、HIF-1α呈負(fù)相關(guān)，BNIP3與HIF-1α呈正相關(guān)，E-cadherin、BNIP3、HIF-1α的檢測均在診治與預(yù)測肺癌病情的嚴(yán)重程度中具有重要的臨床意義，而其相關(guān)機制仍需進(jìn)一步探討。

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