楚玉潔 蔣軍廣 譚偉麗 劉瑞芬 張艷梅 崔永亮 安金路

(鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院河南省呼吸疾病研究所河南省高等學(xué)校臨床醫(yī)學(xué)重點(diǎn)學(xué)科開放實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 450052)

多項(xiàng)研究表明肺癌的發(fā)生既與原癌基因的激活、抑癌基因的失活導(dǎo)致細(xì)胞增生過度和分化異常相關(guān)，而且與細(xì)胞凋亡相關(guān)〔1〕。促凋亡基因、抑凋亡基因、凋亡效應(yīng)基因相互作用共同完成凋亡過程。Fas及其配體FasL是參與細(xì)胞凋亡的一對因子，兩者相結(jié)合誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。本文主要分析凋亡相關(guān)基因Fas/FasL的臨床生物學(xué)意義及在非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)的發(fā)生、發(fā)展中的作用。

1 對象與方法

1.1對象 收集鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院2010～2012年由胸外科手術(shù)切除的手術(shù)標(biāo)本，已經(jīng)病理證實(shí)為NSCLC，共60例作為實(shí)驗(yàn)組，女23例，男37例，年齡45～87〔平均(62.9±17.1)歲〕，腺癌29例，鱗狀細(xì)胞癌31例；按組織學(xué)分級：高分化14例、中分化29例、低分化17例；按照2002年美國聯(lián)合癌癥分類委員會和國際抗癌聯(lián)盟制定的TNM分期標(biāo)準(zhǔn)：Ⅰ期19例、Ⅱ期21例、Ⅲ期17例、Ⅳ期3例；伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移34例，有胸腔積液10例。所選NSCLC的患者均為首次發(fā)現(xiàn)，之前未接受任何方式的抗癌治療。對照組20例均已經(jīng)病理學(xué)證實(shí)為癌旁正常肺組織(距腫瘤邊緣超過3 cm)。

1.2方法

1.2.1主要試劑 兔抗人Fas單克隆抗體、兔抗人FasL單克隆抗體購于北京博奧森生物技術(shù)公司；凋亡試劑盒購于美國羅氏公司；SP試劑盒、二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色劑，購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.2.2免疫組化染色 免疫組化S-P法檢測，步驟：烤片、脫蠟、水化、抗原修復(fù)、滴加一抗及二抗、DAB顯色、蘇木素染色、梯度酒精脫水、中性樹膠封片。

1.2.3細(xì)胞凋亡的檢測 TUNEL法檢測 步驟：脫蠟、水化，滴加蛋白酶K，滴加TUNEL反應(yīng)混合液，滴加過氧化物酶(POD)轉(zhuǎn)換劑，DAB顯色，蘇木素染色，梯度酒精脫水，中性樹膠封片。

1.2.4陽性結(jié)果判定 Fas表達(dá)陽性為細(xì)胞質(zhì)/細(xì)胞膜內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒，F(xiàn)asL表達(dá)陽性為細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒。①細(xì)胞顯色程度：無棕黃色顆粒，顏色與背景無明顯區(qū)別計為0分；有棕黃色顆粒，顏色高于背景底色計為1分；有染色較清晰的棕黃色顆粒，介于1分與3分之間計為2分；深棕黃色顆粒多，顏色明顯比背景顏色強(qiáng)的計為3分。②陽性細(xì)胞比例：0分：無陽性細(xì)胞；1分：陽性細(xì)胞比例<10%；2分：陽性細(xì)胞比例介于10%～50%；3分：陽性細(xì)胞比例>50%。①+②結(jié)果所得分值綜合判斷陽性表達(dá)，最后得分≥4分為表達(dá)陽性，<4分為表達(dá)陰性。

1.2.5凋亡細(xì)胞的陽性結(jié)果判定及凋亡指數(shù)(AI)的計算 凋亡細(xì)胞經(jīng)TUNEL法處理后，細(xì)胞核被染為棕黃色，使用光學(xué)顯微鏡，計數(shù)每1 000個腫瘤細(xì)胞中凋亡細(xì)胞的個數(shù)。AI的計算方法:在400倍視野下任意選取10個視野，計數(shù)所測的凋亡細(xì)胞，AI=凋亡細(xì)胞總數(shù)/計數(shù)總細(xì)胞的數(shù)×100%。

1.3統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS17.0軟件，數(shù)據(jù)比較采取χ2檢驗(yàn)，F(xiàn)as、FasL與細(xì)胞凋亡的關(guān)系用直線相關(guān)分析。

2 結(jié) 果

2.1Fas、FasL陽性表達(dá)率及與臨床病理特征的關(guān)系 Fas在NSCLC組織中表達(dá)的陽性率為46.7%(28/60)，在正常肺組織表達(dá)的陽性率為100%(20/20)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=14.359，P=0.000)。Fas在NSCLC高分化組中的表達(dá)陽性率高于中、低分化組(χ2=7.468，P=0.006)，在TNM分期Ⅰ、Ⅱ期的表達(dá)陽性率高于Ⅲ、Ⅳ期(χ2=5.658，P=0.0017)，但與NSCLC患者的年齡、性別、吸煙、腫瘤直徑、病理分型、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及胸膜轉(zhuǎn)移無關(guān)。見表1。

FasL在NSCLC組織中表達(dá)的陽性率為68.23%(41/60)，在正常肺組織表達(dá)的陽性率為15%(3/20)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=17.239，P=0.000)。FasL在伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者中表達(dá)的陽性率高于不伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者(χ2=10.431，P=0.001)，但與NSCLC患者年齡、性別、吸煙、腫瘤直徑、病理分型、TNM分期、分化程度、胸膜轉(zhuǎn)移無關(guān)。見表1。

表1 NSCLC中Fas、FasL表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系〔n(%)〕

2.2Fas、FasL與細(xì)胞凋亡的關(guān)系 FasL與AI呈負(fù)相關(guān)(r=-0.702，P=0.000)，F(xiàn)as與AI呈正相關(guān)(r=0.732，P=0.000)。見表2。

表2 Fas、FasL分值與AI的關(guān)系

3 討 論

Fas是腫瘤壞死因子(TNF)和神經(jīng)生長因子(NGF)受體家族的一員， FasL是Fas的天然配體，屬于TNF家族的II型跨膜蛋白。兩者通過一系列結(jié)合形成死亡誘導(dǎo)復(fù)合物(DISC)，活化半胱氨酸蛋白酶(Caspase)前體(Pro-caspase-8)為Caspase-8，Caspase-8再由多種途徑裂解、活化等一系列連鎖反應(yīng)激活Caspase家族的其他成員，從而降解多種死亡底物。通過DNA斷裂、核小體形成、染色體凝聚、線粒體通透性改變等細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變降解細(xì)胞的功能蛋白和結(jié)構(gòu)蛋白，至此細(xì)胞凋亡完成。

研究顯示腫瘤細(xì)胞通過Fas的表達(dá)下調(diào)，逃避機(jī)體的免疫監(jiān)視，發(fā)生免疫逃逸，最終腫瘤細(xì)胞惡性增殖，腫瘤最終發(fā)生。李昭輝等〔2〕研究顯示胃癌組Fas陽性表達(dá)低于癌旁正常組織中的陽性表達(dá)。Dai等〔3〕研究顯示，F(xiàn)as在乳腺導(dǎo)管癌中的表達(dá)低于在正常組織中的表達(dá)。Nambu等〔4，5〕的研究均表明，F(xiàn)as在肺癌組織中的表達(dá)低于在正常組織中的表達(dá)。本研究的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與上述研究結(jié)果基本一致，表明腫瘤細(xì)胞通過下調(diào)Fas的表達(dá)，使其不能正常與其配體FasL相結(jié)合，逃避由Fas/FasL介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡過程，達(dá)到無限增殖的目的。提示Fas在NSCLC的發(fā)生、發(fā)展過程中有著重要的作用；而且隨著腫瘤的發(fā)展，分化程度及臨床分級與Fas陽性表達(dá)均有關(guān)系，提示Fas能夠抑制腫瘤發(fā)展；另外，隨著腫瘤進(jìn)展，F(xiàn)as陽性表達(dá)降低，提示Fas可能可以作為判斷NSCLC患者病情進(jìn)展以及判斷預(yù)后的一項(xiàng)指標(biāo)。Esposito等〔6〕研究顯示，F(xiàn)as在NSCLC中的陽性表達(dá)只與有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，而與分化程度無關(guān)，與本研究結(jié)果不一致，原因可能是與種族不同有關(guān)。

腫瘤細(xì)胞表面FasL的表達(dá)上調(diào)，可以使這些腫瘤細(xì)胞發(fā)生免疫逃逸，達(dá)到腫瘤細(xì)胞無限增值的目的。Hahne等〔7〕研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)FasL在黑色素細(xì)胞瘤中的表達(dá)上調(diào)，認(rèn)為FasL可能有助于腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸。鄔素芳等〔8〕研究結(jié)果顯示 FasL在宮頸癌中的表達(dá)高于在正常組織中的表達(dá)，并認(rèn)為FasL的表達(dá)與宮頸癌的病理分級、臨床分期、伴或不伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，最終得出結(jié)論認(rèn)為在宮頸癌組織中Fas低表達(dá)以及FasL高表達(dá)有助于腫瘤細(xì)胞逃避機(jī)體免疫監(jiān)視。本研究結(jié)果顯示FasL在NSCLC中的表達(dá)高于在正常肺組織中的表達(dá)，結(jié)果與Takehara等〔9〕、張曉膺等〔10〕研究結(jié)果一致，表明FasL在NSCLC發(fā)生、發(fā)展過程中有著重大作用，F(xiàn)asL陽性表達(dá)的上調(diào)，可使腫瘤細(xì)胞反擊T細(xì)胞的作用增強(qiáng)，從而達(dá)到腫瘤細(xì)胞逃逸免疫抑制的目的，最終導(dǎo)致NSCLC的發(fā)生。本研究結(jié)果顯示，F(xiàn)asL在NSCLC伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的陽性表達(dá)高于不伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的陽性表達(dá)。與褚曉源〔11〕關(guān)于FasL在NSCLC中的表達(dá)與臨床特征的關(guān)系結(jié)果相一致。

本研究結(jié)果表明，F(xiàn)as、FasL與細(xì)胞的凋亡有密切的關(guān)系，F(xiàn)as的高表達(dá)可通過Fas/FasL介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑，促進(jìn)癌變的細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤的發(fā)生。但FasL的高表達(dá)則使癌變細(xì)胞反擊T淋巴細(xì)胞，避免細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)的殺傷，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的無限惡性增殖，最終使機(jī)體遭受腫瘤的侵襲。

4 參考文獻(xiàn)

1張曉燕，蔣軍廣，翟展藝，等.凋亡相關(guān)基因Survivin 在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)及意義(J〕.中國老年學(xué)雜志，2012；32(11)：2227-8.

2李昭輝，王占民，趙志倫，等，F(xiàn)as、Fas配體和INF-γ在胃癌中的表達(dá)〔J〕.北京大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版),2003；35(4):386-9.

3Dai XL,Zhou SL,Qiu YF，etal.Correlated expression of Fas, NF-kappaB, and VEGF-C in infiltrating ductal carcinoma of the breast〔J〕.Urol J Gynaecol Oncol,2012；33(6)：633 -9.

4Nambu Y,Beer DG.Lack of cell surface Fas/APO-l expression in pulmonary adenocarcinomas 〔J〕.J Clin Invest,1988；101(5)：1102-10.

5Viard-Leveugle I,Veyrenc S,French LE,etal.Frequent loss of Fas expression and function in human lung tumours with overexpression of FasL in small cell lung carcinoma〔J〕.J Pathhol,2003；201(2):268-77.

6Esposito V,Baldi A,Liuzzi G,etal.Analysis of Fas(Apo-1/CD95)expression in non-small cell lung cancer〔J〕.Anticancer Res,2003；23(6C):4901-5.

7Hahne M,Rimold D,Schroter M，etal.Melanoma cell expression of Fas(Apo-1/CD95) ligand:implications for tumor immune escape〔J〕.Science,1996；274(5291):1363-6.

8鄔素芳，張稼聞，邱 敏，等.宮頸癌組織中Survivin、Fas和FasL的表達(dá)及其臨床關(guān)系〔J〕.上海交通大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版),2010；30(9):1138-42.

9Takehara T,Hayashi N.Fas and fas ligand in human hepatocellular carcinoma〔J〕.J Gastroenterol,2001；36(10):727-8.

10張曉膺，狄冬梅，鄭世營，等，非小細(xì)胞肺癌Fas/FasL蛋白的表達(dá)及臨床意義〔J〕.江蘇大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版),2005；15(6):476-8.

11褚曉源，陳龍邦，王靖華，等，非小細(xì)胞肺癌Fas/FasL基因蛋白的表達(dá)及其臨床意義〔J〕.醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報,2003；16(2):83-5.