鄒勤光 所 劍 王大廣 何 亮

(吉林省腫瘤醫(yī)院胸外二科，吉林 長春 130012)

惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)是影響腫瘤病人預(yù)后的重要因素，胃癌的轉(zhuǎn)移方式主要是通過淋巴途徑，即使是早期胃癌，其淋巴轉(zhuǎn)移率也可達(dá)8%～15%〔1〕，而胃癌淋巴結(jié)的微轉(zhuǎn)移可能是導(dǎo)致淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移主要原因。微轉(zhuǎn)移目前尚無統(tǒng)一的概念，一般是指非血液系統(tǒng)的惡性腫瘤在發(fā)展過程中，播散并存活于淋巴系統(tǒng)、血液系統(tǒng)、骨髓、肝、肺等組織器官中的微小腫瘤細(xì)胞灶，常無任何臨床表現(xiàn)〔2〕，普通病理檢查及常規(guī)診斷學(xué)檢查手段很難發(fā)現(xiàn)〔3〕。胃癌的生物學(xué)行為是指反映和表現(xiàn)胃癌性質(zhì)或者惡性程度的指標(biāo)。因此明確胃癌淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移和胃癌生物學(xué)行為之間的關(guān)系對胃癌病人的臨床治療有重要的指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1研究對象 研究組(胃癌淋巴結(jié)臨床轉(zhuǎn)移陰性組)選擇吉林大學(xué)第一醫(yī)院普通外科自2006年3～10月期間經(jīng)病理診斷確定為胃癌，并行D3手術(shù)的患者共83例。取其胃周圍淋巴結(jié)共245枚，且這些淋巴結(jié)經(jīng)常規(guī)病理檢查證實(shí)無臨床轉(zhuǎn)移。陰性對照組選取因胃潰瘍，胃間質(zhì)瘤等其他胃部疾病而行胃大部切除術(shù)的病人8例，淋巴結(jié)共76枚。陽性對照組選取行D3手術(shù)的胃癌患者共31例，淋巴結(jié)141枚，并且這些淋巴結(jié)經(jīng)普通病理檢驗(yàn)證實(shí)有臨床轉(zhuǎn)移。

1.2標(biāo)本選取 所有淋巴結(jié)均經(jīng)過標(biāo)記后，一半送病理科行常規(guī)檢查，另一半立即保存于-70℃低溫冰箱里保存待用。

1.3引物合成 選擇CK18引物及內(nèi)參照基因引物(引物由大連寶生物公司提供),CK上游引物序列：5′ AAGAAAACCCGAAGAGG3′，下游引物：5′ TCTGACTCAAGGTGCAGC3′，擴(kuò)增片段121 bp；β-actin引物序列：上游引物：5′ GTGGGGCGCCCCAGGCACCA3′，下游引物：5′ CTTCCTTAATGTCACGCACGATTTC3′，擴(kuò)增片段500 bp。

1.4Trizol Reagent提取淋巴結(jié)總RNA(total RNA，tRNA) 按照Trizol Reagent說明提取淋巴結(jié)的總RNA，-70℃保存。提取方法如下：取淋巴結(jié)組織約100 mg，置于研磨器中，加入1 ml Trizol Reagent，勻漿。裂解液放入1ml DEPC水泡過并高壓后的Ep管中。室溫孵育5 min，使核蛋白復(fù)合物充分裂解。每管加200 μl氯仿，蓋上管蓋，劇烈翻轉(zhuǎn)15 s，室溫靜置3 min。4℃離心15 min。將上層水相轉(zhuǎn)移到一新的1 ml DEPC水泡過并高壓后的EP管中，加入500 μl異丙醇，室溫靜置10 min。4℃離心10 min。離心后，在試管底部可見白色膠狀沉淀。棄上清，在離心管中加入1 ml 75%的乙醇洗滌RNA沉淀。用混懸器混合離心管，4℃離心5 min。棄上清，空氣中干燥RNA，然后加入50 μl高壓后的DEPC水。取10 μl用紫外分光光度計測OD值，再取4.5 μl進(jìn)行甲醛變性的瓊脂糖凝膠電泳。

2.2CK18 mRNA表達(dá)與患者臨床病理特征的關(guān)系 研究組微轉(zhuǎn)移陽性患者同無淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移的胃癌患者相比，其腫瘤組織分化明顯更差；腫瘤侵犯的深度更深；同時浸潤性生長所占的比率大；Borrmann分型中Ⅲ、Ⅳ型腫瘤所占的比率更大(P<0.05)。而對二者進(jìn)行腫瘤的部位，年齡、性別等因素進(jìn)行比較，結(jié)果無明顯差異(P>0.05)。見表1。

①飲食清淡,忌辛辣次驚性食物,多食新鮮蔬菜。水果。②注意點(diǎn)眼衛(wèi)生:點(diǎn)眼錢用肥皂洗凈雙手,仰臥位,辦開下眼瞼,藥品口距結(jié)膜囊1-2CM,向結(jié)膜囊內(nèi)滴入1-2滴眼液,連續(xù)點(diǎn)兩種或以上眼藥時,需要間隔3-5分鐘,禁止將眼藥點(diǎn)健眼,或者讓家人使用,尤其含激素的眼藥不能隨意點(diǎn),按醫(yī)生要求執(zhí)行和停用。每日正常洗臉,注意用眼衛(wèi)生,單獨(dú)使用一張毛巾,每周用開水煮沸消毒一次,勿揉眼睛,勿讓臟物或臟水進(jìn)入眼內(nèi)。③活動與休息:避免過度用眼,禁止劇烈運(yùn)動,如:跳、跑、抬、舉④部分患者涉及戴鏡或弱視訓(xùn)練,請復(fù)查時嚴(yán)格遵醫(yī)師指使執(zhí)行。⑤按照醫(yī)師指定的時間內(nèi)復(fù)查。

1.7統(tǒng)計學(xué)方法 采用統(tǒng)計軟件SPSS14.0處理。結(jié)果百分率用χ2檢驗(yàn)。

全詩描寫了溫馨的場景：華堂綺窗，佳人對月弦歌，友人酬唱，貴族宴樂，詩人被歌聲和美酒所陶醉，意氣相投，一擲千金而不惜，尾句正是全詩寓意所在。

2 結(jié) 果

微轉(zhuǎn)移的檢測方法有多種。連續(xù)切片是最早用于檢測淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移的一種粗略方法。近年來已很少使用。細(xì)胞培養(yǎng)方法敏感性更高些。欠缺的是條件要求嚴(yán)格，影響環(huán)節(jié)多。免疫組化、免疫熒光和放射免疫檢測具有重要應(yīng)用價值，但單抗的質(zhì)量、交叉反應(yīng)、機(jī)體產(chǎn)生自身抗體等因素影響其敏感性、特異性〔8〕。轉(zhuǎn)基因法〔9〕技術(shù)條件要求高，只能用于實(shí)驗(yàn)研究階段，尚不適用于臨床研究。多參數(shù)的流式細(xì)胞儀已成功應(yīng)用于微轉(zhuǎn)移腫瘤細(xì)胞的識別，但因其方法復(fù)雜、價格昂貴，臨床上很難推廣〔10〕。

1.6數(shù)據(jù)處理分析 應(yīng)用Glyko bandscan分析系統(tǒng)分別測定樣本每個淋巴結(jié)CK18 mRNA及β-actin陽性條帶的總灰度，測量2次取平均值。并計算每個淋巴結(jié)CK18 mRNA/β-actin的值。以CK18 mRNA/β-actin的值≥1.5為CK18 mRNA高度表達(dá)，以CK18 mRNA/β-actin的值<1.5為低度表達(dá)或者不表達(dá)，分別檢驗(yàn)研究組、胃癌淋巴結(jié)臨床轉(zhuǎn)移陽性組及其他胃部疾病組患者淋巴結(jié)CK18 mRNA表達(dá)情況。再對研究組患者中反映腫瘤生物學(xué)行為的因素如腫瘤大體分型、組織學(xué)類型、腫瘤侵犯深度、腫瘤部位等的情況同其淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移的情況相聯(lián)系進(jìn)行比較。

基因檢測具有高度敏感性、特異性，可準(zhǔn)確檢測1 mg組織或1 ml液體中的1個癌細(xì)胞，被認(rèn)為是目前檢測微轉(zhuǎn)移的最有效方法。可檢測的標(biāo)志物種類眾多，如可以檢測異?；騪53〔11〕、ras、ApC、DCC、CD44〔12〕、erb-B2等。

1.5甲醛變性的瓊脂糖凝膠RNA電泳 用35 ml蒸餾水融化0.7 g瓊脂糖，冷卻至60℃左右加入10 ml甲醛和11 ml 5×緩沖液(0.1 mmol/L MOPS PH7.0，40 mmol/L乙酸鈉，50 mmol/L EDTA)混勻，灌制凝膠，將凝膠浸于1×甲醛電泳緩沖液中準(zhǔn)備電泳，每孔上樣20 μl(4.5 μl RNA，2.0 μl 5×緩沖液，3.5 μl甲醛，1.0 μl甲酰胺)，上樣前樣品于65℃加熱15 min，冰水中冷卻，離心后加2.0 μl 10×上樣緩沖液(50%甘油，1.0 mmol/L EDTA，0.25%溴酚藍(lán)，0.25%二甲苯青FF)，混勻后上樣，在100 V電壓下電泳0.5 h，用溴化乙錠染色30 min，紫外分析儀下拍照記錄。紫外分光光度計測定tRNA濃度：取10 μl tRNA溶液，加入990 μl高壓后的DEPC處理水，在260 nm紫外波長下測定tRNA的OD值，計算tRNA含量。RT-PCR擴(kuò)增：逆轉(zhuǎn)錄體系為取25 μl樣本RNA，加oligo dT 3 μl，DEPC水2 μl，70℃孵育5 min，冰浴5 min，加5×Buffer 10 μl，dNTP 4 μl，RNAsin 1 μl，AMV 1 μl，DEPC水4 μl。擴(kuò)增采用Gene Amp PCR System 2400型PCR擴(kuò)增儀進(jìn)行PCR擴(kuò)增，按如下條件進(jìn)行循環(huán)：94℃預(yù)變性5 min，95℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 30 s，共35個循環(huán)，終末72℃延伸10 min。產(chǎn)物用1%瓊脂糖電泳，紫外透射儀下觀察并照相記錄結(jié)果。

*本文為2013年度中央文獻(xiàn)對外翻譯與傳播協(xié)同創(chuàng)新中心項(xiàng)目“中央軍事文獻(xiàn)對外傳播流程研究”（編號：2013XT10）的階段性成果。

圖1 研究組患者CK18 mRNA電泳圖

表1研究組微轉(zhuǎn)移陰、陽性患者CK18mRNA陽性表達(dá)與患者臨床病理特征的關(guān)系〔n(%)〕

臨床病理特征研究組微轉(zhuǎn)移陽性(n=51)微轉(zhuǎn)移陰性(n=32)P值浸潤生長39(76.5)8(25.0) <0.05分化差者43(84.3)13(40.6) <0.05漿肌層及漿肌層以外受侵犯44(86.2)11(34.4) <0.05BorrmannⅢ及Ⅳ型患者比例47(92.1)12(37.5) <0.05腫瘤部位胃上部4(7.8)4(12.5) >0.05胃體部7(13.7)6(18.7) >0.05胃竇部20(39.2)22(68.8) >0.05患者平均年齡(歲)6763 >0.05性別男22(43.1)21(65.6) >0.05女9(17.6)11(34.4) >0.05

3 討 論

胃癌淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移狀況是影響預(yù)后的一個重要因素〔1〕，并且淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、漿膜受侵是胃癌術(shù)后各種復(fù)發(fā)包括術(shù)后早期(術(shù)后24個月以內(nèi))復(fù)發(fā)的危險因素〔2〕。還有些學(xué)者〔3〕認(rèn)為淋巴結(jié)臨床轉(zhuǎn)移陰性的胃癌其臨床病理生物學(xué)特性與早期胃癌相似，手術(shù)后預(yù)后較好，而有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌預(yù)后則較差。對胃癌病人行系統(tǒng)性淋巴結(jié)清掃術(shù)能明顯改善其預(yù)后情況，延長生命，并且不增加手術(shù)并發(fā)癥，術(shù)后5年生存率可達(dá)50%以上〔4，5〕。良好的手術(shù)效果可能與早期診斷(可使臨床病理分期提前)及廣泛徹底的淋巴清掃有關(guān)。Bosing等〔5〕報道胃癌患者行根治性術(shù)后總體5年生存率達(dá)49%，且胃癌病人無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(pTx pN0)或轉(zhuǎn)移局限于胃周淋巴結(jié)(pTx pN1)者行系統(tǒng)性淋巴結(jié)清掃術(shù)后生存率明顯增加。但也有學(xué)者報道認(rèn)為廣泛淋巴清掃不能改善胃癌病人的預(yù)后，且增加手術(shù)并發(fā)癥〔6〕。

微轉(zhuǎn)移是腫瘤轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)的基礎(chǔ)和前提，因此對于微轉(zhuǎn)移灶的檢測有利于判斷患者臨床分期及預(yù)后以及指導(dǎo)治療〔7〕。也正是因?yàn)檫@個原因廣大學(xué)者在積極開展對微轉(zhuǎn)移的檢測方法的研究。本實(shí)驗(yàn)就是應(yīng)用近幾年廣泛開展的半定量RT-PCR技術(shù)以CK18為標(biāo)記檢測胃癌淋巴結(jié)的微轉(zhuǎn)移情況，并把檢測結(jié)果與胃癌的腫瘤生物學(xué)特點(diǎn)進(jìn)行比較分析以明確二者聯(lián)系。

2.1CK18 mRNA表達(dá) 研究組共有83例患者245枚淋巴結(jié)，其中51例(61.4%)患者的125枚(51.1%)淋巴結(jié)CK18 mRNA高度表達(dá)即這些淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移陽性。陰性對照組患者8例淋巴結(jié)76枚CK18 mRNA全部無表達(dá)；陽性對照組患者31例，淋巴結(jié)141枚CK18 mRNA全部高表達(dá)。見圖1。

黨的十八大以來，在應(yīng)對“把綠水青山轉(zhuǎn)化為金山銀山”的問題上，江西因勢而定、乘勢而上，堅持把發(fā)展綠色產(chǎn)業(yè)、促進(jìn)產(chǎn)業(yè)綠色化，作為促進(jìn)經(jīng)濟(jì)發(fā)展與資源環(huán)境相協(xié)調(diào)的基本途徑。

目前以CK家族為標(biāo)志物利用RT-PCR來檢測胃癌淋巴結(jié)是極為常用和非常有效的方法，當(dāng)然，現(xiàn)階段RT-PCR檢測腫瘤微轉(zhuǎn)移尚存在一定局限性。包括缺乏腫瘤特異性靶RNA、靶RNA的非特異性表達(dá)、假陽性和假陰性問題的困擾。但是隨著新的腫瘤特異性靶RNA的發(fā)現(xiàn)、PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化以及定量PCR技術(shù)的不斷成熟〔13〕，涉及腫瘤細(xì)胞的微轉(zhuǎn)移灶的診斷將更為敏感、特異和可靠，相信RT-PCR方法將會成為檢測臨床腫瘤微轉(zhuǎn)移的常規(guī)方法。

長期以來世界各地學(xué)者關(guān)于進(jìn)展期胃癌的手術(shù)中淋巴結(jié)清掃范圍意見不統(tǒng)一〔14，15〕。本研究結(jié)果認(rèn)為胃癌淋巴結(jié)存在較高的微轉(zhuǎn)移。而且普通病理難以發(fā)現(xiàn)的這些淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移，同時我們發(fā)現(xiàn)胃癌淋巴結(jié)的微轉(zhuǎn)移同癌灶浸潤深度、腫瘤的大體類型、組織學(xué)分型等生物學(xué)行為特點(diǎn)密切相關(guān)?？梢悦鞔_遠(yuǎn)站淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移陽性的患者其腫瘤生物學(xué)行為明顯更趨向惡性特點(diǎn)。另一方面僅有微轉(zhuǎn)移的淋巴結(jié)大多數(shù)僅有輕微腫大，容易造成術(shù)中被外科醫(yī)生忽視，導(dǎo)致清掃不徹底，而影響患者預(yù)后。因此我們認(rèn)為，胃癌的根治性手術(shù)中應(yīng)常規(guī)對胃癌各站淋巴結(jié)進(jìn)行清掃以降低術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)的概率。另一方面我們也主張在術(shù)后應(yīng)該對這些遠(yuǎn)站淋巴結(jié)進(jìn)行微轉(zhuǎn)移的檢測并根據(jù)結(jié)果指導(dǎo)術(shù)后的治療及判斷腫瘤的臨床分期。當(dāng)然這個結(jié)論還有待于對這些患者的預(yù)后進(jìn)行跟蹤隨訪而進(jìn)一步明確。

不過哥哥講故事的時候，翠姨總比我們留心聽些，那是因?yàn)樗哪挲g稍稍比我們大些，當(dāng)然在理解力上，比我們更接近一些哥哥的了。哥哥對翠姨比對我們稍稍的客氣一點(diǎn)。他和翠姨說話的時候，總是“是的”“是的”的，而和我們說話則“對啦”“對啦”。這顯然因?yàn)榇湟淌强腿说年P(guān)系，而且在名分上比他大。

胃癌的合理分期對于指導(dǎo)選擇綜合治療方案，判斷療效及預(yù)后具有重要的意義。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明研究組中所有患者按照傳統(tǒng)的TNM分期均應(yīng)該為N0 期，然而對照組中胃癌淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移陽性的病人其各項(xiàng)腫瘤生物學(xué)行為特點(diǎn)與淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移陰性的病人相比均又顯著差異，胃癌淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移陽性的病人其腫瘤生物學(xué)行為特點(diǎn)惡性程度更高。因此是淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移情況對胃癌患者進(jìn)行臨床分期的劃分和預(yù)后的判斷的不可忽視的重要因素，應(yīng)該成為TNM分期的一項(xiàng)重要參考指標(biāo)。但是由于胃癌淋巴結(jié)的微轉(zhuǎn)移由于檢測起來相對要求更高的實(shí)驗(yàn)室技術(shù)及實(shí)驗(yàn)人員技術(shù)，并需要一定時間，而且現(xiàn)在沒有為廣大學(xué)者公認(rèn)的檢測胃癌淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移的簡單，可靠，而且有效的方法。因此對胃癌淋巴結(jié)的微轉(zhuǎn)移的檢測在臨床上的應(yīng)用價值還有待探討，其具體意義有待進(jìn)一步探索和闡述。

總之，通過本實(shí)驗(yàn)可以看出胃癌淋巴結(jié)的微轉(zhuǎn)移與胃癌的各種生物學(xué)行為特點(diǎn)密切相關(guān)，其微轉(zhuǎn)移的情況因該作為臨床中指導(dǎo)胃癌的臨床分期及治療方法的一個重要參考條件，但是由于本實(shí)驗(yàn)時間有限制，缺乏對患者5年生存率的直觀觀察因此對于胃癌淋巴結(jié)尤其是遠(yuǎn)站淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移陽性與患者預(yù)后情況還有待進(jìn)一步的研究。

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