張 明 溫都蘇 任 明 李然偉 劉祿成

(吉林大學第二醫(yī)院泌尿外科，吉林 長春 130041)

膀胱尿路上皮癌男性明顯多于女性，且易復發(fā)。隨著對腫瘤分子生物學研究的深入和癌基因?qū)W說的確立，靶向基因制劑聯(lián)合化療預防腫瘤治療后復發(fā)的抗腫瘤治療策略成為目前腫瘤研究與治療的熱點之一。缺氧誘導因子(HIF)-1α在多種惡性腫瘤組織中表達，并被證實既能促進腫瘤生長也與化療耐藥和患者不良預后有關(guān)〔1～3〕。本文針對HIF-1α設(shè)計了反義HIF-1α聯(lián)合絲裂霉素C(MMC)治療裸鼠原位膀胱癌的實驗研究，旨在為臨床膀胱癌的治療制定更加實用有效的新方案提供參考。

1 材料與方法

1.1主要材料來源 人膀胱癌T24細胞株購自中國科學院上海細胞所。BALB/C裸鼠購自中國醫(yī)學科學院實驗動物研究所。原位凋亡檢驗法(TUNEL)試劑盒和噻唑藍(MTT)比色儀分別購自北京中山生物公司和美國Sigma公司。MMC來自日本山丸株式會社制藥公司。ESDREF1.5T三維核磁掃描儀購自德國西門子公司。反義HIF-1α載體由本實驗室構(gòu)建〔4〕。

1.2實驗方法步驟 ①按照參考文獻〔4〕所述方法步驟，構(gòu)建人膀胱癌細胞裸鼠原位膀胱移植瘤模型和療效評價及瘤體標本處理。選取30只瘤體大小幾乎相同的成瘤裸鼠，隨機分為三組，10只/組，每隔7 d分別經(jīng)尿道膀胱灌注反義HIF-1α載體+MMC，反義HIF-1α載體，MMC，均灌注4次/組，28 d為1個療程。每隔9 d，即灌注后的第2天用ESDREF1.5T核磁掃描儀檢測腫瘤體積。在實驗結(jié)束后的第5天處死所有裸鼠，迅速切開膀胱，完整剝?nèi)×鲶w稱重，并用游標卡尺測量腫瘤的長徑和短徑，以長(mm)×寬(mm)計算出腫瘤大小，然后按病理常規(guī)要求切片備檢。② MTT法檢測瘤細胞增殖。5 μm厚的組織切片依次脫蠟→脫水→雙氧水封閉→滴加MTT顯色液→磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌→抗地高辛抗體孵育→蘇木素復染。以PBS代替MTT顯色液作為陰性對照，陽性對照切片經(jīng)DNA酶Ⅱ處理后按MTT法程序染色，實驗重復3次。結(jié)果判定：細胞胞漿呈棕黃色者為增殖細胞陽性。每張切片觀察5個視野，每個視野計數(shù)100個細胞，胞漿呈棕黃色的細胞在切片視野中所占百分率的均值即為瘤細胞的增殖率。見圖1。③ TUNEL法檢測瘤細胞凋亡率。繼續(xù)用②中處理的標本，不同的是，更換MTT顯色液為TUNEL反應(yīng)液，用PBS代替TUNEL作為陰性對照。陽性對照切片經(jīng)DNA酶Ⅰ處理后按TUNEL試劑盒所示染色步驟進行。結(jié)果判定：胞核呈黃褐色的細胞為凋亡細胞，其在每張切片，每個視野計數(shù)100個細胞中所占百分率的均值為瘤細胞凋亡率。見圖1。

圖1 T24細胞的增殖、凋亡情況(×400)

1.3統(tǒng)計學方法 應(yīng)用SPSS15.0統(tǒng)計軟件進行t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1聯(lián)合和單一用藥治療對成瘤裸鼠腫瘤細胞增殖和凋亡的影響 MTT法檢測結(jié)果 反義HIF-1α制劑+MMC用藥和反義HIF-1α載體及MMC單獨治療組瘤細胞的增殖率分別是：(19.8±3.7)%,(48.6±5.9)%,(35.8±7.4)%。各治療組腫瘤細胞雖均發(fā)生不同水平的增殖抑制現(xiàn)象，但以聯(lián)合用藥組增殖抑制最為明顯，與單獨用藥的兩組分別比較，差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)。TUNEL法檢測瘤細胞凋亡率的結(jié)果依次是聯(lián)合組(82.6±5.7)%,反義HIF-1α組(43.7±8.4)%,MMC組(57.9±4.8)%,聯(lián)合用藥組瘤細胞凋亡率明顯高于單獨用藥組(P<0.05)。

2.2聯(lián)合和單一用藥治療對成瘤裸鼠腫瘤生長的影響 聯(lián)合治療組、反義HIF-1α和MMC治療組的腫瘤體積從第9、21、30天開始，均不同程度的逐漸變小。實驗結(jié)束后測得聯(lián)合組和單獨組的腫瘤大小依次是〔(15.28±6.37)mm2〕，〔(31.94±5.72)mm2〕，〔(27.85±3.81)mm2〕。單獨用藥兩組相對比，差異雖無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，但聯(lián)合用藥組分別與單一用藥組比較，差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)。

2.3聯(lián)合和單一用藥治療對成瘤裸鼠淋巴轉(zhuǎn)移的影響 單純基因制劑和單純化療治療的10只成瘤裸鼠中均出現(xiàn)4只膀胱外盆腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，轉(zhuǎn)移率高達40%，而基因治療+化療治療的10只成瘤裸鼠中僅1只轉(zhuǎn)移，轉(zhuǎn)移率為10%。組間比較差異顯著(P<0.01)。

3 討 論

研究表明，缺氧在實體腫瘤中普遍存在，缺氧微環(huán)境不僅參與腫瘤細胞增殖、凋亡、侵襲、轉(zhuǎn)移及血管生成等調(diào)控，而且上調(diào)耐藥基因表達，選擇性抗凋亡〔5～7〕。HIF-1α為近年來發(fā)現(xiàn)的一種是細胞在基因轉(zhuǎn)錄水平協(xié)調(diào)缺氧變化的主要調(diào)節(jié)因子，其過度表達時可明顯抑制腫瘤細胞凋亡，促進腫瘤細胞增殖，從而加速腫瘤生長轉(zhuǎn)移〔8，9〕。鎖核酸(LNA)類寡核苷酸代表第三代反義技術(shù)，對靶向mRNA具有很高的特異親合性和強大的組織穩(wěn)定性，人們將其主要應(yīng)用于基因研究和抑制腫瘤基因表達方面〔10，11〕。本研究結(jié)果提示：① 膀胱癌T24細胞株中過表達的HIF-1α可以通過反義HIF-1α載體抑制。② 單一基因制劑或細胞毒抗癌藥物雖對腫瘤細胞有抑制作用，但不能達到理想的治療效果。③ 基因制劑與化療藥物聯(lián)合治療，明顯優(yōu)于單一用藥。

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