梁一波 劉衍宇 鄧玉麗 張 衍 葉志東 羅 虹 關(guān)俊文

(湛江市第二人民醫(yī)院臨床時間醫(yī)學(xué)實驗室，廣東 湛江 524003)

阿爾茨海默病(AD)患者的腦組織常發(fā)生一系列病理改變，特別是海馬β-淀粉樣蛋白(Aβ)等自由基明顯增多，神經(jīng)細(xì)胞變性、壞死，AD可以使機體的生物節(jié)律消失，其中靜息-活動近日節(jié)律的紊亂就是其中的一個具體表現(xiàn)〔1〕。褪黑素(MT) 是由大腦松果體分泌的一種神經(jīng)內(nèi)分泌激素,有抗腦細(xì)胞損傷作用,是神經(jīng)細(xì)胞抗氧化作用較強的活性物質(zhì)之一〔2〕，AD 病人腦脊液中MT水平低下，腦室壁和海馬Aβ沉積及鈣化斑形成等神經(jīng)毒性作用可能是AD發(fā)病的重要途徑，MT可能通過對Aβ自由基的調(diào)控，發(fā)揮鈣子離對腦組織的保護作用〔3〕。本文探討MT對小鼠自主活動近日節(jié)律和認(rèn)知能力的調(diào)節(jié)作用。

1 材料與方法

1.1儀器和試劑 DW-5腦立體定位儀、ZZ小鼠自主活動測試儀、200-Morris水迷宮購自四川成都泰盟科技有限公司、貝克曼LD20生化分析儀及上?？迫A生物制品公司試劑盒；Aβ1-42，Sigma 公司產(chǎn)品,用無菌生理鹽水將其溶解稀釋成1 μg/μl，放置于4℃冰箱備用。MT，Sigma 公司產(chǎn)品,臨用前用無水乙醇溶解,再加生理鹽水配制,乙醇終濃度為5%。

1.2實驗動物分組 BALB/c小鼠，體重(18±2) g,由廣東醫(yī)學(xué)院動物實驗中心供給。隨機分為3組，即AD模型組(AD組)、褪黑素調(diào)節(jié)組(MT組)、假手術(shù)組(NS組)，每組各24只。具體處理如下：①MT組：右側(cè)腦室注入Aβ1～422 μl，術(shù)后3 d再用MT 5 mg/kg腹腔注射連續(xù)10 d。②AD組：右側(cè)腦室注入Aβ1～422 μl，術(shù)后3 d再用等量5 %乙醇生理鹽水腹腔注射連續(xù)10 d。③NS組右側(cè)腦室注入人工腦脊液2 μl，術(shù)后3 d再用等量5%乙醇生理鹽水腹腔注射連續(xù)10 d。

1.3模型制作 用0.45%戊巴比妥鈉10 ml/kg麻醉小鼠，將其固定于腦立體定位儀上，頭頂部備皮、絡(luò)合碘消毒后切開小鼠顱頂皮膚，暴露顱骨，參照小鼠腦立體定位圖譜〔4〕，用牙科鉆鉆一小孔定位于右側(cè)腦室前囟點后1 mm，中線旁開2 mm處，深2.5 mm，通過腦立體定位儀與微量注射器緩慢注入Aβ1～422 μl留針5 min，術(shù)后常規(guī)飼養(yǎng)。

1.4標(biāo)本制作 術(shù)后2 w進(jìn)行行為學(xué)測驗，然后每組小鼠24 h內(nèi)，每隔4 h隨機取出4只，摘眼球取血液分離血清，斷頭后迅速取腦組織勻漿高速離心取上清液，把血清和腦漿上清液編號-20℃保存待測。

1.5測定指標(biāo) ①自主活動節(jié)律分析：用ZZ小鼠自主活動測試儀，在全亮環(huán)境下自主飲食，每3 min記錄1次小鼠活動次數(shù)，共記錄7 d。②認(rèn)知能力：采用Morris水迷宮測試認(rèn)知能力。實驗前訓(xùn)練3 d，先將小鼠置于水迷宮中自由游泳2 min，以適應(yīng)水迷宮的環(huán)境，訓(xùn)練2次/d，120 s/次，每次訓(xùn)練間隔30 min，選擇平臺的對角象限中環(huán)入水，將小鼠面朝池壁放入水池，任其游泳直至找到平臺。正式實驗為1 d，每組小鼠連續(xù)24 h里每隔4 h測試1次，小鼠尋找平臺的時間和軌跡，由Morris水迷宮視頻跟蹤系統(tǒng)自動記錄各組小鼠逃避潛伏期及到達(dá)平臺全程，其數(shù)量大小與小鼠空間學(xué)習(xí)記憶成績負(fù)相關(guān)。③所有血清和腦漿上清液標(biāo)本同批測定，用生化分析儀測定各組標(biāo)本鈣離子濃度。

2 結(jié) 果

2.1MT對AD模型小鼠自主活動近日節(jié)律的調(diào)節(jié) 小鼠側(cè)腦室注Aβ1～42術(shù)后第14天，放入ZZ小鼠自主活動測試儀檢測各組小鼠的自主活動度。NS組小鼠自主活動近日節(jié)律明顯，AD模型組小鼠自主活動度近日節(jié)律消失，表明Aβ1～42對小鼠的活動度有顯著的影響，使其靜息-活動的近日節(jié)律紊亂，MT組小鼠的近日節(jié)律再現(xiàn)，只是時相有變,提示MT可改善Aβ1～42所致AD小鼠的自主活動近日節(jié)律。見圖1。

2.2MT對AD模型小鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力的調(diào)節(jié) 用Morris水迷宮視頻跟蹤系統(tǒng)檢測各組小鼠1 d的6個時點(0：00、4：00、8：00、12：00、16：00、20：00)的空間學(xué)習(xí)記憶能力變化趨勢。NS組與MT組空間學(xué)習(xí)記憶能力的平均潛伏期晝夜變化均呈明顯波動結(jié)構(gòu)，存在近日節(jié)律,且潛伏期短；而AD組平均潛伏期變化幾乎平直，近日節(jié)律消失。組間兩因素方差分析,AD組小鼠平均潛伏期較NS組與MT組顯著延長(P<0.01)，上述結(jié)果提示，AD組小鼠學(xué)習(xí)記憶能力差；MT可顯著改善AD模型小鼠學(xué)習(xí)記憶近日節(jié)律。見表1。

2.3MT對AD模型小鼠血清及腦室鈣含量的調(diào)節(jié) 在行為檢測結(jié)束后,3組小鼠在一天6個時點(0：00、4：00、8：00、12：00、16：00、20：00、22：00)，各組隨機抽4個小鼠摘眼球取血液并立即斷頭取腦勻漿離心，取上清液用生化分析儀測定鈣的含量，結(jié)果NS組小鼠與MT組小鼠血清及腦鈣離子濃度晝夜變化存在近日節(jié)律，AD組小鼠近日節(jié)律消失。與NS組和MT組比較,AD組小鼠各時點血清鈣顯著下降(P<0.01)，腦組織鈣顯著上升(P<0.01) 。NS組與MT組12：00、16：00時點血清鈣和8：00、12：00、20：00時點腦漿鈣水平比較無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，表明Aβ1～42可誘發(fā)大腦組織鈣化增加；MT對Aβ1～42誘發(fā)大腦組織鈣化有對抗作用。見表2。

圖1 各組小鼠第7天自主活動直方圖

與MT組比較：1)P<0.05，2)P<0.01，下表同

表2 各組小鼠血清和腦漿晝夜6個不同時點鈣濃度

3 討 論

生物節(jié)律是許多生物體固有的以晝夜周期性變化為基礎(chǔ)的一種生命屬性，其中以近日節(jié)律最為顯著，某些疾病發(fā)生、發(fā)展與生物節(jié)律變化密切相關(guān)。已有實驗證明Aβ是各種原因誘發(fā)AD的共同通路，AD加速松果體的退行性變，加重松果體的鈣化程度，松果體的細(xì)胞也顯著減少，這些病理改變均可影響機體的生物節(jié)律〔5〕。MT是體內(nèi)最強的自由基清除劑，具有對抗Aβ神經(jīng)毒性作用，MT能抑制氧自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、保護細(xì)胞脂質(zhì)膜的完整性，從而維持細(xì)胞內(nèi)鈣調(diào)節(jié)系統(tǒng)的平衡，避免因為細(xì)胞內(nèi)的鈣超載而造成的細(xì)胞死亡〔3〕。作為第二信使，鈣離子控制許多生理過程。靜息狀態(tài)下胞漿中Ca2+水平很低，細(xì)胞內(nèi)外的Ca2+濃度差大，Ca2+可通過胞漿上的Ca2+通道或胞內(nèi)Ca2+庫的釋放通道提高胞漿中Ca2+濃度，從而引起各種生理活動〔6〕。Ruthrich等〔7〕用摘除松果體制作AD小鼠模型，結(jié)果顯示海馬Ca2+濃度異常增高，同時伴有小鼠海馬神經(jīng)元凋亡增多，從而證實松果體的主要激素MT可抑制細(xì)胞內(nèi)Ca2+的升高提出Ca2+可能參與了AD患者神經(jīng)元細(xì)胞死亡過程，他們發(fā)現(xiàn)過多的Ca2+進(jìn)入神經(jīng)元會導(dǎo)致細(xì)胞死亡。

本研究采用Aβ注入腦室制作AD小鼠模型并以MT干預(yù)，結(jié)果表明，Aβ與嗜神經(jīng)細(xì)胞依賴性鈣離子受體結(jié)合引發(fā)Ca2+內(nèi)流，最終導(dǎo)致神經(jīng)元功能障礙， AD小鼠模型晝夜活動近日節(jié)律消失。MT能明顯減少AD小鼠的異常活動，并顯著改善神經(jīng)元損害造成的自主活動和學(xué)習(xí)記憶能力近日節(jié)律，MT組與AD組相比學(xué)習(xí)記憶能力明顯改善，近日節(jié)律再現(xiàn)，其機制可能是MT抑制腦細(xì)胞Ca2+內(nèi)流以發(fā)揮抗AD作用。

4 參考文獻(xiàn)

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