王靜波

(解放軍第309醫(yī)院眼科，北京 100091)

肝細胞生長因子(HGF)是目前已知的生物活性最廣泛的生長因子之一。HGF通過與特異性膜受體c-met結合而發(fā)揮其多樣生物學作用。除了促進有絲分裂活性外，HGF還作為離散因子促進細胞擴散和遷移。研究證實，HGF/c-met在組織器官損傷后的再生中發(fā)揮重要作用。本研究觀察糖尿病大鼠肝臟中HGF的表達變化。

1 材料與方法

1.1試劑 鏈脲佐菌素(STZ，Sigma公司，美國)，兔抗鼠HGF多克隆抗體(Santa Cruz公司，美國)，枸櫞酸鹽粉劑、磷酸鹽緩沖液(PBS)粉劑、二步法免疫組化檢測試劑盒、DAB試劑盒、蘇木素(北京中杉金橋生物技術有限公司，北京)，安穩(wěn)血糖儀及血糖測試條(長沙三諾有限公司)，冷凍包埋劑(櫻花，美國)。

1.2實驗動物及模型制備 雄性SD大鼠24只，SPF級，體質量(120±20 g)，由軍事醫(yī)學科學院動物中心提供。大鼠在SPF級動物中心飼養(yǎng)，室內溫度25℃左右，濕度約50%。明暗周期12 h，自由飲水和進食。適應性喂養(yǎng)1 w后，進行動物造模。

造模前，禁食12 h(不禁水)。STZ 65 mg/kg腹腔注射，對照組腹腔注射枸櫞酸鹽溶液。72 h后測血糖，隨機血糖≥16.7 mmol/L即為造模成功。每周監(jiān)測血糖。

1.3標本制備 造模成功后第3、6、9、12和15周，分別采用過量氯胺酮麻醉致死，迅速摘除肝臟。切取塊狀肝臟大葉組織，冷凍包埋劑包埋，連續(xù)切出5 μm厚度切片，貼于免疫組化專用防脫載玻片上，晾干后甲醇固定，-80℃冰箱保存。

1.4免疫組化染色及結果判讀 冰凍切片用PBS沖洗，3%過氧化氫溶液室溫10 min，PBS洗，稀釋的HGF抗體(1∶200)室溫孵育2 h，通用型IgG抗體-辣根過氧化物酶多聚體37℃ 20 min，PBS洗，DAB顯色，PBS洗，蘇木素復染，自然水沖洗，梯度酒精及二甲苯脫水，中性樹膠封片，照相。所有切片由同一位經(jīng)驗豐富的病理科醫(yī)師盲法閱片做出判定，每張切片觀察5個×400視野。以組織切片背景清晰、細胞漿染為淡黃至棕黃色為陽性細胞標志。結果判定標準如下：不著色者為陰性，淡黃色及著色細胞<1/3為弱陽性，黃色及著色細胞占1/3～1/2為中度陽性，棕褐色著色陽性細胞>1/2為強陽性。

2 結 果

2.1糖尿病大鼠一般情況觀察 對照組大鼠體重增加明顯，精神狀況良好，毛皮有光澤，動作自如，反應靈敏。糖尿病大鼠出現(xiàn)了典型的“三多一少”癥狀，多飲、多食、多尿，明顯消瘦，精神逐漸萎靡，早期多動，后期反應遲鈍，動作緩慢，毛豎而無光澤。12 w時，部分大鼠出現(xiàn)白內障。

2.2肝臟一般結構觀察 對照組大鼠肝小葉結構清晰，肝細胞索排列整齊。糖尿病組大鼠肝小葉結構紊亂，肝細胞的胞質內可見大量小空泡。糖尿病12 w時，肝細胞開始水腫；糖尿病15 w時，肝細胞水腫尤明顯。

2.3肝細胞HGF的表達 對照組大鼠肝細胞HGF呈弱陽性表達。糖尿病3 w時，肝細胞HGF表達即開始增強。糖尿病6 w時，肝細胞HGF呈中度陽性表達。糖尿病12 w時，肝細胞HGF呈強陽性表達。糖尿病15 w時，肝細胞HGF的表達較12 w時減弱，但較對照組仍明顯增強。見圖1。

圖1 大鼠肝臟肝細胞生長因子的表達 (免疫組化，×200)

3 討 論

在美國，肝臟病變是2型糖尿病患者死亡的主要原因之一。2型糖尿病患者肝臟病變的標準死亡率遠遠高于心血管并發(fā)癥的標準死亡率。糖尿病肝臟病變包括非酒精性脂肪肝病、肝硬化、肝細胞性肝癌、慢性肝炎、急性肝功能衰竭，其中最常見的是非酒精性脂肪肝病。非酒精性脂肪肝病在2型糖尿病患者中發(fā)病率達50%，在糖尿病伴肥胖患者中發(fā)病率近100%〔1，2〕。

HGF是一種分泌型肝素親和糖蛋白，由間質細胞產生，與受體c-met結合并激活該受體的酪氨酸酶活性，促進肝細胞、上皮細胞、內皮細胞、造血細胞等多種細胞的生長、遷移、形態(tài)變化〔3〕。HGF對肝細胞有直接保護作用，可改善肝纖維化、降低死亡率〔4〕。在高表達HGF的轉基因小鼠，半乳糖胺對肝細胞的損傷幾乎被完全抑制。在肝臟部分切除后，肝細胞HGF的表達增強，促進了肝細胞的增殖，促進損傷的修復〔5〕。因而，HGF是肝細胞的保護劑。除了保護肝細胞外，HGF可保護機體的很多細胞，如腎小球細胞、腎小管細胞、血管內皮細胞、胰島細胞〔6，7〕。高糖刺激的血管內皮細胞、腎小管上皮細胞及腎小球細胞，HGF的表達均表現(xiàn)為先增高后減低的趨勢〔6〕。與對照組相比，胰島過度表達HGF的轉基因小鼠，胰島體積增大，胰島數(shù)量增多，β細胞復制率提高〔7，8〕。HGF干預能使糖尿病大鼠β細胞凋亡指數(shù)顯著降低〔8〕。

在糖尿病早期，高糖損傷引起機體防御反應，肝細胞HGF表達增加，促進細胞有絲分裂，對損傷的細胞進行修復；隨著高糖刺激時間的延長，機體防御反應的能力逐漸下降，高糖誘導了細胞的凋亡，HGF表達下調。Araújo等〔9〕的研究表明，HGF/c-met可能在肝臟胰島素信號轉導中起重要作用。

在本研究中，筆者觀察到糖尿病肝臟中HGF蛋白呈先增高后減低的趨勢改變。但HGF的這種變化對肝細胞的作用及其作用機制尚需更進一步的研究。

4 參考文獻

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4任春峰，陳會松，王青霞.促肝細胞生長因子對ConA致小鼠肝損傷保護機制探討〔J〕.中國實驗診斷學，2008；12(12):1483-5.

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6劉青娟，何 寧，劉淑霞，等.糖尿病腎病大鼠腎小管上皮細胞轉化與肝細胞生長因子的表達〔J〕.中國慢性病預防與控制，2005；13(6):266-8.

7陳洪流，蒙碧輝，黃 松，等.羅格列酮對糖尿病大鼠殘存胰島表達肝細胞生長因子的影響〔J〕.中國糖尿病雜志，2010；18(1):63-6.

8Dai C，Huh CG，Thorgeirsson SS,etal.Beta-cell-specific ablation of the hepatocyte growth factor receptor results in reduced islet size，impaired insulin secretion，and glucose intolerance〔J〕.Am J Pathol，2005；167:429-36.

9Araújo TG，Oliveira AG，Carvalho BM,etal.Hepatocyte growth factor plays a key role in insulin resistance-associated compensatory mechanisms〔J〕.Endocrinology，2012；153:5760-9.