楊 彬 余麗娟 王 佳 趙 磊 胡馨月 紀超男 魏玉玲 陽群芳 蔣青松 楊俊卿

(重慶醫(yī)科大學藥理教研室 重慶市生物化學與分子藥理學重點實驗室，重慶 400016)

缺血性腦損傷可分為局部腦缺血與全腦缺血損傷。局部腦缺血模型，多數(shù)學者認為可模擬臨床上的中風。而全腦缺血模型除了模擬中風外，更側重于模擬臨床上的窒息、休克、心臟驟停、嚴重心律失常以及低氧血癥的腦損傷〔1〕。局部腦缺血的主要模型為大腦中動脈阻塞(MCAO)模型，而全腦缺血損傷的模型主要有四動脈結扎模型，雙動脈結扎合并低血壓模型，窒息性心臟驟停模型〔2〕。目前國內外廣泛采用Pulsinelli 四血管阻斷法制作動物全腦缺血再灌注模型〔3〕，但是其造模過程復雜。由于大鼠腦血管的解剖結構與人類相似，因而認為大鼠是建立腦缺血損傷模型最適宜的動物。激光多普勒血流(LDF)測定法是一種準確反映微循環(huán)灌注的測量手段〔4〕，Schmid-Elsaesser等〔5〕發(fā)現(xiàn)持續(xù)腦血流監(jiān)測可以用來證明MCAO模型制作是否成功，但LDF在全腦缺血再灌注(I/R)損傷模型中的研究還未見報道。本實驗參照國內外常用的二血管阻斷加低血壓法〔6，7〕，并使用LDF對其進行優(yōu)化，建立一種手術操作簡單、死亡率低、重復性好的大鼠全腦缺血再灌注模型，為進一步深入探討腦缺血損傷的發(fā)病機制、病理特點及其防治打下良好的實驗基礎。

1 材料與方法

1.1動物及分組 SPF級雄性Sprague Dawley大鼠33只，體重200～250 g，由重慶醫(yī)科大學實驗動物中心提供，合格證書編號SCXK(渝)2007-0001。飼養(yǎng)于SPF環(huán)境中，溫度25 ℃±1 ℃,相對濕度50%±2%。12 h光照晝夜節(jié)律，自由飲水，手術前12 h禁食。動物實驗隨機分假手術組(n=7)；LDF監(jiān)測I/R組(LDF+I/R組，n=13)，無LDF監(jiān)測I/R組(I/R組，n=13)。每組大鼠取3只用于組織病理學檢測，其余大鼠用于SOD活性,MDA含量測定。所有與動物相關的實驗操作，均在重慶醫(yī)科大學道德與倫理委員的許可和指導下進行。

1.2主要儀器與試劑 多普勒激光血流儀(Moor 公司；VMS-LDF1型；英國)；Morris 水迷宮(中國醫(yī)學科學院藥物研究所)；熒光正置顯微鏡(Olympus;日本)；丙二醛試劑盒，超氧化物歧化酶試劑盒(南京建成試劑有限公司)

1.3模型制作 參照Gr?gaard〔6〕，羅維楠〔7〕等的方法并稍作改進，大鼠用4%水合氯醛(1 ml/100 g)腹腔注射麻醉，使大鼠處于仰臥位并固定于鼠解剖板，頸正中剃毛，縱向剪開頸部皮膚約2 cm，鈍性分離組織和肌肉，暴露并小心分離出雙側頸總動脈與一側頸總靜脈，下穿約5 cm絲線備用。結扎頸總靜脈遠心端，在近心端剪一切口。將連接于注射器針頭上的聚乙烯導管(預先肝素內浸泡)沿頸總靜脈切口處向心臟方向插入，插管后輸入2 ml肝素生理鹽水(250 U/100 ml)。緩慢抽取大鼠總血量約30%的血液。提起頸總動脈下預先備置的絲線，無創(chuàng)性微動脈夾夾閉雙側頸總動脈20 min，計時松開動脈夾，緩慢回輸血液，拔出導管，結扎頸總靜脈近心端，縫合傷口，強力碘消毒。假手術組大鼠不阻斷血流，不抽血，其余過程與手術組大鼠相同。手術過程中大鼠肛溫保持在36.5 ℃～37.2 ℃。

1.4腦血流測定 用LDF監(jiān)測大鼠整個手術過程中的腦血流(CBF)變化,大鼠腹腔注射4%水合氯醛(1 ml/100 g)麻醉，俯臥，頭部剃毛，剪開頭部皮膚約2 cm，用浸滿過氧化氫的棉簽拭去滲出液，暴露出顱骨，將多普勒血流儀的探頭用膠水固定于顱骨上，并使大鼠處于仰臥位，進行I/R手術，LDF記錄大鼠手術過程中的CBF變化。

1.5水迷宮 考慮到動物手術后傷口愈合，在術后8～12 d進行水迷宮測定大鼠空間學習與記憶能力。整個測試過程分為二個階段：第一階段(定向航行)，每天晚上8點至10點訓練，訓練4 d，第一天訓練時將大鼠放到隱蔽于水中的平臺上讓其適應10 s，然后讓其自由游泳找到平臺，180 s內未找到平臺者，實驗者協(xié)助將其引至平臺。從第二天起，每天訓練4次，將大鼠分別從A、B、C、D 4個位置，面向池壁放入水中，讓大鼠定向航行；第二階段(空間檢測)，在第5天時進行測試，并將大鼠從前一天最后一次訓練時的位置放入水中，記錄大鼠第一次登上平臺的時間，即尋臺潛伏期(超過180 s記為180 s)，水迷宮上方安置攝像機，同步記錄大鼠尋臺運動軌跡。

1.6組織病理學檢查 三組大鼠水迷宮測試完成后，各取3只，4%水合氯醛腹腔注射麻醉，4%多聚甲醛在體腦組織固定。HE染色觀察皮層與海馬神經元結構形態(tài)變化，于連續(xù)3個高倍鏡視野下，計數(shù)核固縮、核壞死神經元數(shù)目占總神經元數(shù)目的百分率，作為神經元組織形態(tài)學改變的相對量〔7〕。

1.7SOD和MDA含量測定 水迷宮完成后，將剩下的大鼠斷頸法處死，冰面分離皮層海馬組織，液氮速凍，然后保存于-80℃低溫冰箱，用時將組織取出，用生理鹽水制成10 g/L的勻漿液。以黃嘌呤氧化酶法測定SOD活性，TBA法檢測MDA含量，具體操作按說明書進行。

2 結 果

2.1動物存活率 假手術組及有LDF監(jiān)測組大鼠術后全部存活，無死亡；無LDF監(jiān)測組1只大鼠手術過程中死亡，2只大鼠術后24 h死亡，存活率76.92%，明顯低于其他兩組(P<0.01)。

2.2LDF監(jiān)測大鼠I/R模型的腦血流變化 假手術組大鼠在實驗過程中基線血流為(184.25±10.80)PU，手術過程中大鼠采用腹式呼吸，呼吸的深淺、手術時觸碰到血管等因素都會影響血流波動。在分離頸總動脈時，牽扯到迷走神經，影響到動物的呼吸，可造成腦血流值小幅降低。分離完成后，動物呼吸恢復正常，血流值也恢復正常。

圖1 I/R過程中腦血流動態(tài)變化

全腦缺血成功大鼠缺血前，基線腦血流平均值(167.49±10.69)PU,夾閉雙側頸總動脈后，血流值迅速降低，在缺血20 min過程中腦血流平均值為(40.71±6.10)PU，血流降幅75%；夾閉完成，取下動脈夾后，血流迅速回升，在觀察期內腦血流平均值為(116.00±6.55)PU，再灌注時，血流恢復至缺血前基線血流的70.46%。見圖1。

圖2 三組大鼠在第5天的尋臺路徑

2.3I/R對大鼠空間學習記憶能力的影響 三組大鼠尋臺潛伏期隨著訓練天數(shù)的增加而逐漸減少。與假手術組比較，兩組I/R組大鼠尋臺潛伏期顯著延長，尋臺路徑也明顯增加；有、無LDF監(jiān)測兩組大鼠尋臺潛伏期、尋臺路徑無顯著差異。見圖2，表1所示。

2.4I/R損傷對大鼠腦組織病理形態(tài)結構的影響 假手術組大鼠皮層神經元細胞形態(tài)正常,輪廓清晰。I/R組大鼠皮層神經元細胞排列較紊亂，胞核固縮深染，呈致密濃染塊狀或顆粒狀，有的細胞界限不清,結構消失；而有、無LDF監(jiān)測兩組大鼠之間神經元損傷無顯著性差異。見圖3，圖4，表2。

2.5I/R損傷對大鼠皮層海馬組織SOD活性和MDA含量變化的影響 與假手術組比較，另兩組I/R組大鼠皮層海馬SOD活性顯著下降(P<0.01)，MDA含量顯著升高(P<0.01)，而有無LDF監(jiān)測組大鼠之間SOD活性、MDA含量無顯著性差異。見表3。

表1 I/R對大鼠尋臺潛伏期及第5天尋臺路徑的影響

表2 各組大鼠皮層海馬神經元計數(shù)

表3 I/R對大鼠皮層海馬組織SOD活性、MDA含量變化的影響

圖3 大鼠皮層組織病理學(HE，×400)

圖4 大鼠海馬CA1區(qū)組織病理學(HE，×400)

3 討 論

全腦缺血再灌注的原理為夾閉雙側頸總動脈時，兩側頸總動脈的血液供應停止,而兩側椎動脈的血流仍可通過基底動脈流至大腦動脈環(huán)，從頸靜脈抽取一定量血液可以有效降低缺血期后交通動脈血流量,從而減少后交通動脈的代償作用,使腦缺血更為明顯。缺血完成后解除兩側頸總動脈的阻斷,并回輸從頸總靜脈抽出的血液，使大腦的血流恢復,實現(xiàn)再灌注。

本研究的創(chuàng)新點在于通過LDF監(jiān)控手術過程中CBF的變化以降低動物死亡率，同時增加造模成功率。LDF測定法是一種準確反映微循環(huán)灌注的測量手段〔4〕。劉宇等〔8〕用LDF判斷活體大鼠MCAO模型制作成功與否，發(fā)現(xiàn)LDF的檢測結果與TTC染色證實腦梗死病灶具有很好的一致性，符合率達到88%，Harada等〔9〕用LDF評價MCAO模型，發(fā)現(xiàn)持續(xù)腦血流監(jiān)測可以減少腦梗死體積的變異系數(shù)，減少制作過程中動物死亡率。本實驗在此基礎上對前期建立的I/R模型進行進一步的改良與優(yōu)化。

研究認為腦血流減少至45%就能夠影響大腦的能量代謝〔10〕。本實驗根據(jù)大鼠體重抽取約總血量30%的血液并夾閉雙側頸總動脈實現(xiàn)I/R損傷，但由于個體差異的存在，抽取30%血量并夾閉雙側頸總動脈后，部分大鼠CBF降低卻少于55%，對這部分大鼠來說此操作可能只是使其“血量減少”，而不能稱為缺血，若將這部分大鼠直接納入實驗結果中，必然會出現(xiàn)假陽性的結果，通過LDF的監(jiān)測，對這部分大鼠應多抽取血量并使其CBF降低至45%以下，以實現(xiàn)缺血的效果；而部分大鼠夾閉后CBF已經降低至缺血的閾值，但出現(xiàn)心跳急劇增加，呼吸困難等癥狀，其缺血太多，應部分回輸血液再夾閉其雙側頸總動脈并控制其CBF降低的幅度在55%以上。

水迷宮檢測表明I/R對大鼠空間學習記憶能力產生明顯損傷。HE結果說明I/R對大鼠神經元產生嚴重損傷。氧化應激在缺血性腦損傷中發(fā)揮著重要作用〔11〕。本文說明I/R導致機體氧化應激損傷。

綜上所述，I/R大鼠空間學習記憶障礙顯著，神經元損傷，氧化應激損傷明顯，此模型可用于腦缺血再灌病理生理和形態(tài)學等變化及某些藥物和治療手段的基礎研究。

4 參考文獻

1Krafft PR,Bailey EL,Lekic T,etal.Etiology of stroke and choice of models〔J〕.Int J Stroke,2012;7(5):398-406.

2Harukuni I,Bhardwaj A.Mechanisms of brain injury after global cerebral ischemia〔J〕.Neurol Clin,2006;24(1):1-21.

3Pulsinelli WA,Brierley JB.A new model of bilateral hemispheric ischemia in the unanesthetized rat〔J〕.Stroke,1979;10(3):267-72.

4Basak K,Manjunatha M,Dutta PK.Review of laser speckle-based analysis in medical imaging〔J〕.Med Biol Eng Comput,2012;50(6):547-58.

5Schmid-Elsaesser R,Zausinger S,Hungerhuber E,etal.A critical reevaluation of the intraluminal thread model of focal cerebral ischemia:evidence of inadvertent premature reperfusion and subarachnoid hemorrhage in rats by laser-Doppler flowmetry〔J〕.Stroke,1998;29(10):2162-70.

6Gr?gaard B,Gerdin B,Arfors KE.Forebrain ischemia in the rat.Relation between duration of ischemia,use of adjunctive ganglionic blockade and long-term recovery〔J〕.Stroke,1986;17(5):1010-5.

7羅維楠，楊俊卿，姜 蓉，等.美洛昔康對全腦缺血再灌注大鼠腦損傷的作用觀察〔J〕.中國藥理學通報，2010；26(11)：1459-62.

8劉 宇，孟 然，閆 峰，等.激光多普勒血流儀評價活體大鼠大腦中動脈栓塞模型成功的可行性分析〔J〕.中國病理生理雜志，2011；27(3)：620-4.

9Harada H,Wang Y,Mishima Y,etal.A novel method of detecting rCBF with laser-Doppler flowmetry without cranial window through the skull for a MCAO rat model〔J〕.Brain Res Brain Res Protoc,2005;14(3):165-70.

10Ekl?f B,Siesj? BK.The effect of bilateral carotid artery ligation upon the blood flow and the energy state of the rat brain〔J〕.Acta Physiol Scand,1972;86(2):155-65.

11Manzanero S,Santro T,Arumugam TV.Neuronal oxidative stress in acute ischemic stroke:sources and contribution to cell injury〔J〕.Neurochem Int,2013;62(5):712-8.