周翔宇 劉 寧 閆 珊 張志超 孫連坤

(吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)系，吉林 長(zhǎng)春 130021)

目前卵巢癌是威脅女性健康的一個(gè)重要問(wèn)題，化療成為主要的治療手段〔1〕。然而，化療藥物特異性差，其藥物的損害作用也會(huì)攻擊周圍的正常組織，健康器官進(jìn)一步被損害，從而帶來(lái)更大的損傷。研究發(fā)現(xiàn)S1能誘導(dǎo)肝癌、乳腺癌等腫瘤細(xì)胞凋亡〔2，3〕，本實(shí)驗(yàn)組之前的研究發(fā)現(xiàn)S1能有抑制卵巢癌細(xì)胞生存〔4〕，因此本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探討S1誘導(dǎo)人卵巢癌細(xì)胞(SKOV3)細(xì)胞死亡機(jī)制，檢測(cè)S1對(duì)細(xì)胞線粒體凋亡途徑的影響，為S1進(jìn)入臨床治療卵巢癌提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1試劑與細(xì)胞 S1 由大連理工大學(xué)精細(xì)化工國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)并提供；十二烷基硫酸鈉(SDS)、四甲基二乙胺(TEMED)、丙烯酰胺、N,N-二甲基雙丙烯酰胺、吐溫-20和疊氮鈉物購(gòu)自北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司；胎牛血清、IMDM培養(yǎng)基購(gòu)美國(guó)HyClone公司；胰酶購(gòu)自美國(guó)Thermo公司；線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒(JC-1)和細(xì)胞裂解液購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所；Bcl-2、Bax、細(xì)胞色素(Cyto)C抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司；β-actin購(gòu)自EPITOMICS公司；二抗購(gòu)自美國(guó)Pierce公司。SKOV3細(xì)胞系由吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室提供。

1.2細(xì)胞培養(yǎng) SKOV3細(xì)胞培養(yǎng)在37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)，用含10%胎牛血清的IMDM培養(yǎng)基常規(guī)方法培養(yǎng)，0.25%胰酶消化傳代，取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞分組進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3JC-1檢測(cè)線粒體膜電勢(shì) 收集細(xì)胞，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌1～2次，加入500 μl JC-1染色液，37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育20 min；3 000 r/min，4℃ 離心5 min，棄上清；加入1 ml預(yù)冷的JC-1緩沖液(1×)洗滌2次；加入200～300 μl JC-1緩沖液(1×)混勻；用流式細(xì)胞儀檢測(cè)分析。

1.4Western 印跡 離心收集細(xì)胞，PBS 洗滌2次；加入細(xì)胞裂解液并提取蛋白，測(cè)濃度后取60 μg蛋白進(jìn)行SDS-聚丙烯凝膠(PAGE)電泳；采用BIO-RAD轉(zhuǎn)移裝置將蛋白移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜；轉(zhuǎn)膜結(jié)束后將PVDF膜放入5% 的脫脂奶粉中1～2 h，封閉膜上的非特異結(jié)合位點(diǎn)；加入相應(yīng)的一抗，4℃冰箱中過(guò)夜。次日PBS洗膜3次；加入1∶1 000稀釋二抗室溫孵育1.5 h；PBS洗膜3次；二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，凝膠成像系統(tǒng)采集圖像后保存。

2 結(jié) 果

2.1JC-1染色檢測(cè)線粒體膜電勢(shì) Bcl-2蛋白家族是S1誘導(dǎo)線粒體途徑凋亡的關(guān)鍵分子，一旦表達(dá)失衡，會(huì)導(dǎo)致線粒體膜通透性改變，線粒體膜電勢(shì)(ΔΨ)降低。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道〔4〕，選取5、10 μmol/L S1作用SKOV3細(xì)胞8 h，JC-1染色，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞熒光強(qiáng)度。S1作用SKOV3細(xì)胞熒光強(qiáng)度明顯降低，表明線粒體膜電勢(shì)(ΔΨ)明顯降低(P<0.05，n=3)。

2.2Western 印跡方法檢測(cè)S1對(duì)SKOV3細(xì)胞Cyto C蛋白表達(dá)的影響 當(dāng)細(xì)胞受到內(nèi)源性凋亡刺激時(shí)，線粒體膜孔道開(kāi)放，電勢(shì)下降，致使線粒體內(nèi)Cyto C釋放入胞質(zhì)，胞質(zhì)中Cyto C的含量明顯增加。與對(duì)照組相比，S1作用SKOV3細(xì)胞8 h，胞漿Cyto C蛋白表達(dá)顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，n=3)。見(jiàn)圖1。

圖1 S1對(duì)人卵巢癌細(xì)胞胞漿Cyto C蛋白表達(dá)影響

2.3S1影響線粒體凋亡相關(guān)蛋白的活化 Bcl-2和Bax都是線粒體凋亡途徑的標(biāo)志性蛋白，當(dāng)細(xì)胞受到內(nèi)源性凋亡刺激時(shí)，抑凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)降低，促凋亡蛋白Bax活化，進(jìn)而激活下游caspase。5、10 μmol/L S1作用SKOV3細(xì)胞8 h，Bcl-2蛋白表達(dá)明顯降低，Bax蛋白表達(dá)增加，Bax/ Bcl-2表達(dá)顯著升高(P<0.05，n=3)。見(jiàn)圖2。

圖2 S1對(duì)人卵巢癌細(xì)胞Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)影響

3 討 論

細(xì)胞死亡是生命組成最基本的部分，在同一個(gè)組織中，多種細(xì)胞死亡方式可能都會(huì)被誘導(dǎo)，但凋亡的誘導(dǎo)往往是最快的〔5〕。凋亡也被稱為程序性細(xì)胞死亡(PCD)，是通過(guò)內(nèi)源性和外源性兩條途徑，外源性凋亡的發(fā)生主要是通過(guò)細(xì)胞表面死亡受體誘導(dǎo)，而內(nèi)源性凋亡主要通過(guò)打擊線粒體膜的穩(wěn)定性〔6，7〕。通過(guò)結(jié)構(gòu)和功能研究發(fā)現(xiàn)，在內(nèi)源性凋亡過(guò)程中，主要是Bcl-2蛋白家族中促凋亡蛋白和抑凋亡蛋白之間的蛋白相互作用，從而控制線粒體的完整性〔8，9〕。大量的研究表明線粒體與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)，其中線粒體跨膜電位的破壞，被認(rèn)為是細(xì)胞凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)過(guò)程中最早發(fā)生的事件之一，它發(fā)生在細(xì)胞核凋亡特征(染色質(zhì)濃縮、DNA斷裂)出現(xiàn)之前，一旦線粒體跨膜電位崩潰，則細(xì)胞凋亡不可逆轉(zhuǎn)。

細(xì)胞凋亡調(diào)控是多基因參與的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)，Bcl-2蛋白是重要的凋亡抑制基因。有研究表明，在抗凋亡蛋白Bcl-2過(guò)表達(dá)的細(xì)胞內(nèi)，當(dāng)化療藥物作用的時(shí)候，會(huì)促使Apaf-1、Cyto C和caspase形成聚集體(Apoptosome)，這個(gè)聚集體會(huì)阻止Cyto C的釋放，以及抑制caspase的活化和級(jí)聯(lián)反應(yīng)。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)Bcl-2在腫瘤中的高表達(dá)可以使腫瘤細(xì)胞耐藥性增高。因此，特異性的靶向作用Bcl-2抗凋亡蛋白，已經(jīng)成為治療腫瘤的新方法〔10〕。目前對(duì)于Bcl-2蛋白家族抑制劑的研究越來(lái)越多，并且合成了很多作用靶點(diǎn)不同的Bcl-2抑制劑，包括HA14-1、GX15-070、BI-33、ABT 737等。實(shí)際上，應(yīng)用我國(guó)自行研制小分子BH3-only蛋白模擬物S1，與抗凋亡蛋白Bcl-2和Mcl-1蛋白均具有高度的親和性，是Bcl-2和Mcl-1的雙重抑制劑〔2～4〕。本研究結(jié)果提示S1通過(guò)破壞線粒體膜電勢(shì)，迫使線粒體內(nèi)大量Cyto C釋放入胞漿誘導(dǎo)SKOV3細(xì)胞發(fā)生凋亡。既往的研究表明，在正常狀態(tài)下，Bcl-2通過(guò)與Bax結(jié)合抑制Bax蛋白活性，進(jìn)而抑制細(xì)胞凋亡。當(dāng)BH3-only蛋白通過(guò)其BH3區(qū)域與Bcl-2結(jié)合，釋放的Bax在線粒體外膜形成寡聚體孔道，因而可以破壞線粒體膜電勢(shì)〔8，9〕。本研究結(jié)果提示S1可能是通過(guò)抑制Bcl-2蛋白，使得Bax蛋白活性增加，從而介導(dǎo)線粒體膜電勢(shì)的改變，釋放Cyto C，觸發(fā)線粒體途徑凋亡。

目前對(duì)于S1治療卵巢癌的研究?jī)H限于體外實(shí)驗(yàn)研究，還需進(jìn)一步進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究，為靶向Bcl-2抗腫瘤藥物S1治療卵巢癌提供了實(shí)驗(yàn)與理論依據(jù)。

4 參考文獻(xiàn)

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