姜文國 張樹平 董秀紅 楊 茗 亢澤春

本研究選取80例淋巴瘤病例，包括非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin’s lymphoma，NHL)病例70例，霍奇金病(hodgkin’s disease，HD)10例，利用不同的4-1BBL抗體，在蛋白水平檢測了4-1BBL的表達(dá)轉(zhuǎn)變?yōu)閟4-1BBL(soluble 4-1BB ligand)的情況，并結(jié)合患者基本情況分析4-1BBL轉(zhuǎn)變與疾病進(jìn)展和類型的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 淋巴瘤病例組織芯片

淋巴瘤組織芯片(NHL803)購自西安艾麗娜生物科技有限公司，含70例非霍奇金淋巴瘤，包括彌漫型B細(xì)胞淋巴瘤44例，結(jié)節(jié)-彌漫型B細(xì)胞性淋巴瘤6例，B細(xì)胞性黏膜相關(guān)性淋巴瘤、濾泡型非霍奇金淋巴瘤各3例，淋巴漿細(xì)胞樣淋巴瘤2例，Burkitt樣淋巴瘤、濾泡中心細(xì)胞性非霍奇金淋巴瘤、外套細(xì)胞淋巴瘤、淋巴母細(xì)胞性T細(xì)胞性淋巴瘤、T細(xì)胞性淋巴瘤、彌漫型透明T細(xì)胞淋巴瘤、Lennert淋巴瘤各1例，間變性大細(xì)胞淋巴瘤5例；10例霍奇金病。所有的組織在采集的時(shí)候都遵循最高的道德標(biāo)準(zhǔn)，將全部的信息都告知捐獻(xiàn)者，并征得他們的同意。

1.2 主要抗體和試劑

檢測4-1BBL C端的抗體(sc-11817)購自SANTA CRUZ公司，檢測4-1BBL N端的抗體(2305-1)購自Abcam公司；利妥昔單抗(Rituximab，美羅華)購自上海羅氏公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗羊、抗兔和抗人抗體HRP-IgG、濃縮型DAB試劑盒均為北京中杉金橋公司產(chǎn)品。

1.3 免疫組織化學(xué)染色分析

將組織芯片于60℃烤箱中烘烤2 h。然后二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化；3% H2O2室溫孵育 5～10 min，以消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性；抗原熱修復(fù)；5%的牛血清白蛋白(BSA)封閉；沖洗后加入利妥昔單抗以及2種4-1BBL抗體孵育過夜；沖洗后分別加入抗人、抗兔和抗羊抗體HRP-IgG；然后采用中杉公司DAB顯色試劑盒顯色，蘇木精復(fù)染，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。在光鏡下，陽性細(xì)胞顯示出棕褐色，Leica顯微鏡低倍鏡下照相保存結(jié)果[1]。

1.4 結(jié)果判斷

相同光照條件、相同放大倍數(shù)下，每個(gè)組織均單獨(dú)保留1張全組織的照相結(jié)果。免疫組化照片應(yīng)用Image-Pro Plus 6.0軟件中的Pathology批處理程序，分別對4-1BBL N端和C端的抗體對淋巴瘤組織的結(jié)合情況進(jìn)行計(jì)算累計(jì)光密度值(integrated optical density，IOD)，結(jié)合鏡下照片確立陽性和陰性標(biāo)準(zhǔn)(IOD值超過500萬為陽性)，并結(jié)合患者臨床資料進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析[2-3]。因?yàn)槊總€(gè)組織芯片的面積基本一致，故相關(guān)性分析根據(jù)具體IOD值按計(jì)量資料進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 CD20抗原在淋巴瘤組織中表達(dá)情況

排除在實(shí)驗(yàn)過程中脫落后不完整的2例組織，余78例有效淋巴瘤，經(jīng)軟件分析，結(jié)合免疫組化切片染色情況，設(shè)立淋巴瘤組織芯片累計(jì)光密度值500萬為分界線，超過500萬者為陽性。淋巴瘤病例組織中，CD20表達(dá)陽性占66.7%。淋巴瘤組織中CD20陽性率與患者年齡及性別無顯著相關(guān)性；與腫瘤病理類型相關(guān)， HD患者CD20抗原的表達(dá)水平顯著高于NHL患者(表1)。

2.2 4-1BBL在淋巴瘤組織中的表達(dá)情況

采用N端抗體檢測的是總4-1BBL的表達(dá)水平，而C端抗體主要檢測膜結(jié)合型4-1BBL的表達(dá)水平，故總體IOD值N端測定組大于C端測定組。結(jié)果表明，4-1BBL表達(dá)水平與患者年齡、性別及病理類型等無顯著相關(guān)性，只是HD患者N端4-1BBL表達(dá)水平較NHL患者略高(表2)。另外，對同一組織，采用2種不同抗體分別測定4-1BBL的 IOD值，發(fā)現(xiàn)兩者IOD值并無顯著相關(guān)性(P>0.05)。這說明不同的患者4-1BBL轉(zhuǎn)變?yōu)閟4-1BBL的比率是隨機(jī)的。

表1 組織芯片分析CD20抗原在淋巴瘤組織中的表達(dá)情況

表2 組織芯片分析4-1BBL抗原在淋巴瘤組織中表達(dá)情況

3 討論

CD20表面抗原分子量約為35 kD的，是B淋巴細(xì)胞表面特有的分化抗原，它參與了B細(xì)胞的增殖、分化、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和鈣離子的跨膜傳遞等多種功能。它表達(dá)于90%以上的B淋巴瘤細(xì)胞和正常B淋巴細(xì)胞，在造血干細(xì)胞、原始B淋巴細(xì)胞、正常血細(xì)胞以及其他組織上不表達(dá)。CD20分子具有不易脫落、與抗體結(jié)合后不內(nèi)化、在人體血清中無游離形式存在等特征。因此，作為治療B 細(xì)胞淋巴瘤的理想作用靶點(diǎn)受到了人們的關(guān)注。自1997年利妥昔單抗(Rituximab，美羅華)批準(zhǔn)上市至今，抗CD20治療性單克隆抗體發(fā)展迅速?，F(xiàn)在臨床上有多種以CD20抗原為靶點(diǎn)的藥物[4]。

本研究中采用利妥昔單抗作為陽性對照測定淋巴瘤患者組織細(xì)胞表面CD20抗原的水平，可以在免疫組化染色分析實(shí)驗(yàn)中保證操作的規(guī)范性。另外，結(jié)果中我們發(fā)現(xiàn)，CD20在淋巴瘤組織的陽性率與病理類型相關(guān)，在HD患者，CD20抗原的表達(dá)顯著高于NHL患者。當(dāng)然，國外也有報(bào)道，利妥昔單抗在治療淋巴細(xì)胞為主性霍奇金病(lymphocyte predominance Hodgkin’s disease，LPHD)中有一定療效，本研究中的10例HD，其中有4例是LPHD。很多治療經(jīng)驗(yàn)也表明對于CD20表達(dá)陽性的HD患者，利妥昔單抗是有效的。最近研究也表明，在HD患者的化療，尤其是應(yīng)用抗CD20抗體進(jìn)行治療方面，其R-S細(xì)胞CD20抗原的表達(dá)水平具有指導(dǎo)意義[5]。

s4-1BBL(soluble 4-1BB ligand) 是4-1BBL的可溶性形式，可以檢測到幾種不同分子量的s4-1BBL。有研究表明： s4-1BBL也是有活性的，在有固定的抗-CD3存在時(shí)，它能夠傳遞協(xié)同刺激信號給外周T細(xì)胞。就目前的研究結(jié)果看，產(chǎn)生s4-1BBL至少存在2種機(jī)制。第一，體外研究發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑(matrix metalloproteinase inhibitor，MMPI )能部分阻斷因細(xì)胞激活導(dǎo)致的s4-1BBL的釋放，明顯減少s4-1BBL的水平，從而增加細(xì)胞膜表面的4-1BBL，這說明s4-1BBL可能是由基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP )切割產(chǎn)生的[6]。第二，通過選擇性剪接，4-1BBL缺失跨膜區(qū)直接轉(zhuǎn)變?yōu)閟4-1BBL，釋放出來[7]。2種方式，都造成其逃脫了宿主淋巴細(xì)胞的免疫監(jiān)視，并且減少通過4-1BBL作用到腫瘤細(xì)胞的凋亡信號。本研究中發(fā)現(xiàn)，采用N端和C端2種抗體測定4-1BBL表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)兩者并無顯著相關(guān)性。這說明在不同的患者，4-1BBL轉(zhuǎn)變?yōu)閟4-1BBL的比率是不同的。

另外，在研究我們使用了Image-Pro Plus 6.0軟件中的Pathology批處理程序?qū)M織芯片染色結(jié)果進(jìn)行計(jì)算量化處理。應(yīng)用這種計(jì)算機(jī)輔助的圖像分析程序，能很大程度上避免鏡下觀察染色結(jié)果的主觀傾向性，結(jié)果更加可靠和準(zhǔn)確。同時(shí)因?yàn)榻M織芯片面積非常一致，也非常適合采用Pathology批處理程序快速計(jì)算IOD值，省時(shí)省力。通過IOD值的比較也能夠獲得較手工統(tǒng)計(jì)更多的生物學(xué)信息[8]。本研究發(fā)現(xiàn)在大多數(shù)病例， N端測定組IOD值顯著大于C端測定組，說明很多s4-1BBL是通過MMP直接切割導(dǎo)致的；另外也有部分病例兩者差別不大，或者結(jié)果正好相反C端測定組IOD值顯著大于N端測定組，這說明也有部分s4-1BBL是直接表達(dá)出來轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞外的。綜上所述，我們進(jìn)一步明確了s4-1BBL的產(chǎn)生機(jī)制，為淋巴瘤的免疫治療提供了重要的指導(dǎo)。

[1] 仰麗麗，文 劍.p21和Survivin 在胃癌組織中的表達(dá)及臨床意義〔J〕.實(shí)用癌癥雜志，2013，28(5)：483-485.

[2] Xavier LL，Viola GG，F(xiàn)erraz AC，et al.A simple and fast d-ensitometric method for the analysis of tyrosine hydroxylase immunoreactivity in the substantia nigra pars compacta and in the ventral tegmental area〔J〕.Brain Res Brain Res Protoc，2005，16(1-3)：58-64.

[3] Shi H，Hayes M，Kirana C，et al.TUFM is a potential new prognostic indicator for colorectal carcinoma〔J〕.Pathology，2012，44(6)：506-512.

[4] Robak T.Emerging monoclonal antibodies and related age-nts for the treatment of chronic lymphocytic leukemia 〔J〕.Future Oncol，2013，9 (1)：69-91.

[5] Rassidakis GZ，Medeiros LJ，Viviani S，et al.CD20 expression in Hodgkin and Reed-Sternberg cells of classical Hodgkin's disease：associations with presenting features and clinical outcome〔J〕.J Clin Oncol，2002，20(5)：1278-1287.

[6] Scholl N，Loibl J，Kremser A，et al.The role of soluble and cell-surface expressed 4-1BB ligand in patients with malignant hemopoietic disorders〔J〕.Leuk Lymphoma，2009，50(3)：427-436.

[7] 宋 敏，張樹平，徐 珞.CD137L在急性髓細(xì)胞白血病中的突變表達(dá)及臨床意義〔J〕.濱州醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2012，35(5)：332-334.

[8] Wang CJ，Zhou ZG，Holmqvist A，et al.Survivin expression quantified by Image Pro-Plus compared with visual assessment〔J〕.Appl Immunohistochem Mol Morphol，2009，17(6)：530-535.