尤濤++董洲++張可可

摘 要：構(gòu)建含嚙齒目動(dòng)物小鼠的CD59a功能片段及6×His鍵的質(zhì)粒載體，將其轉(zhuǎn)染入原核生物表達(dá)體系BL21大腸桿菌，擴(kuò)增，裂解細(xì)菌，層析柱純化，得到CD59a功能多肽，并運(yùn)用SDS-PAGE鑒定其分子量，經(jīng)典及替代途徑溶血實(shí)驗(yàn)鑒定其生物活性。結(jié)果表明：利用基因工程的方法在原核BL21大腸桿菌表達(dá)體系中可制備有良好的抑制補(bǔ)體溶血活性的小鼠CD59a功能多肽，其分子量約18.4KDa，為嚙齒目動(dòng)物CD59的功能研究以及進(jìn)一步的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：CD59；原核生物表達(dá)體系；生物工程

中圖分類(lèi)號(hào) Q78 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào)1007-7731（2014）13-23-03

CD59是一種以糖基磷脂酰肌醇（GPI）錨著于細(xì)胞膜表面的補(bǔ)體抑制蛋白，廣泛分布于動(dòng)物多種組織細(xì)胞表面，并能以游離形式存在于尿液、唾液、淚液等多種體液中。CD59在補(bǔ)體系統(tǒng)激活后的酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)的終末，阻礙C8與C9分子的結(jié)合，抑制補(bǔ)體終末反應(yīng)物MAC（C5b－C9n復(fù)合物）的形成，從而保護(hù)細(xì)胞免受MAC導(dǎo)致的細(xì)胞裂解效應(yīng)［1-2］。故CD59與動(dòng)物的免疫系統(tǒng)密切相關(guān)，可抵御病原微生物激活補(bǔ)體對(duì)動(dòng)物組織細(xì)胞的殺傷作用，是動(dòng)物自體免疫調(diào)節(jié)的重要膜蛋白。獲得具有良好生物活性的CD59功能多肽，有助于對(duì)CD59功能的進(jìn)一步研究。筆者嘗試應(yīng)用組織工程技術(shù)，利用原核的大腸桿菌BL21表達(dá)體系制備重組嚙齒目動(dòng)物小鼠的CD59a功能部位多肽，并應(yīng)用溶血實(shí)驗(yàn)鑒定其生物學(xué)活性，為嚙齒目動(dòng)物CD59的功能研究以及進(jìn)行進(jìn)一步的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 研究對(duì)象 BL21大腸桿菌，由中國(guó)科技大學(xué)大分子結(jié)構(gòu)與功能實(shí)驗(yàn)室提供；Pat28a質(zhì)粒（其圖譜見(jiàn)圖1）：his鍵連接位點(diǎn)為Ndel，購(gòu)自美國(guó)novagen公司。

1.1.2 主要試劑 IPTG （isopropyl beta-D-thiogalactoside，I prepared at 1 M），美國(guó)invitrogen 公司；BugBuster Master Mix 細(xì)胞裂解液，美國(guó)novagen公司；cocktail 蛋白酶，美國(guó)novagen公司；SDS-PAGEmarker，美國(guó)TEDIA公司；His－Bind 純化Kit，美國(guó)Novagen 公司。

1.1.3 主要儀器 -80℃深低溫冰箱，美國(guó)Farma Scientific公司，Eppendorf5414臺(tái)式高速離心機(jī)，德國(guó)Eppendorf公司；Eppendorf5810R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，德國(guó)Eppendorf公司；紫外分光光度計(jì)UVC-515型，美國(guó)ULTRA-LUM公司；恒溫細(xì)菌培養(yǎng)搖床，美國(guó)lab-line instruments公司；垂直電泳儀，美國(guó)Bio-Rad公司；Vortex-Genie 2多功能旋渦混合器，美國(guó)Scientific Industries；U-Tube?蛋白收集器，美國(guó)novagen公司。

圖1 Pat28a質(zhì)粒圖譜

1.2 方法

1.2.1 小鼠CD59功能多肽質(zhì)粒載體的構(gòu)建 根據(jù)genebank及Uniport得到小鼠CD59a功能部的基因序列。CD59a功能部-6his序列：共228bp GAATTCCTCACAT GCTACCACTGTTTCCAACCGGTGGTTTCTTCATGCAATATGAACAGCACTTGCTCTCCTGACCAGGATTCCTGTCTCTATGCTGTAGCCGGAATGCAAGTGTATCAAAGGTGTTGGAAACAATCAGATTGTCATGGTGAGATCATTATGGACCAATTAGAAGAGACAAAATTAAAATTCAGATGCTGCCAGTTTAACTTGTGTAACTAGCTCGAG。

引物設(shè)計(jì)為：上游引物—5′GGAATTCCATATGCTCACATGCTACCAC；

下游引物—5′CCGCTCGAGTTAGTTACACAAGTTAAAC。

應(yīng)用分子克隆技術(shù)構(gòu)建小鼠CD59功能多肽的Pat28a質(zhì)粒載體。

1.2.2 小鼠CD59a功能多肽的表達(dá)、純化 取感受態(tài)BL21細(xì)胞100μL，加入質(zhì)粒5μL，混勻混合物，在冰上放置20min，再放入42℃的水浴中90s，然后在冰上冷卻1～2min。加入LB培養(yǎng)基800μL，置于37℃搖床（100～150r/min），震蕩45min。200μL菌液鋪于氨芐青霉素的瓊脂平板表面。37℃培養(yǎng)溫箱內(nèi)培養(yǎng)24h。表達(dá)：第一天：挑取單克隆接種于5μLB（100μg/mL氨芐青霉素）培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶中，225r/min，37℃培養(yǎng)高密度細(xì)菌一夜；第二天：過(guò)夜菌5μL加入1 000mL LB培養(yǎng)液的大瓶中，37℃搖床上搖晃小于2h，分光儀檢測(cè)OD600值（0.8～1.0）。當(dāng)OD600值在0.8～1.0時(shí)，加入IPTG，1∶1 000稀釋?zhuān)趽u床上搖晃24h，225r/min。取出細(xì)菌培養(yǎng)液在4℃離心機(jī)中5 000r/min，約6min，保存沉淀在-20℃冰箱。在菌沉淀中加入ddH20超聲波碎菌20min，16 000r/min離心，取上清。純化第四天：過(guò)濾后的上清加到層析柱中，分別加入Binding buffer、Elute Buffer及Strip buffer洗脫下來(lái)在4℃冷室內(nèi)或冰上收集洗脫液，即是純化出的小鼠CD59a功能多肽。

1.2.3 小鼠CD59功能多肽的濃縮 蛋白多肽樣品加NaCl補(bǔ)加到0.3M NaCl。超濾管插入冰上預(yù)冷，在附有5KD膜中加入樣品500μL，將內(nèi)管套入外管，14 520r/min離心30min后，將內(nèi)管倒置套入另一個(gè)干凈離心管中3 880r/min離心收集濃縮后蛋白樣品。樣品放入自動(dòng)控制凍干機(jī)中，真空冷凍干燥。

1.2.4 蛋白質(zhì)變性聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）鑒定重組CD59多肽及純度 先行制備12%5mL分離膠及5%2mL濃縮膠。按1∶1體積加入提取的蛋白多肽液10μL和凝膠上樣緩沖液10μL。同時(shí)取同蛋白質(zhì)marker和凝膠上樣緩沖液混合。在100℃加熱3min變性，加樣后將電泳。卸下玻璃板剝膠，把膠浸泡在5倍體積的染色劑中，緩慢平搖脫色4～8h。將膠取出放在白熾燈下拍照（見(jiàn)圖2）。

1.2.5 溶血實(shí)驗(yàn)

1.2.5.1 經(jīng)典途徑 準(zhǔn)備紅細(xì)胞：正常健康小鼠抗凝血，離心機(jī)3min，4 000r/min。每管吸取紅細(xì)胞沉淀14μL，再加入1 000μLPBS清洗2次，最后一次由GVB++清洗一次。加入GVB++900μL后分管。羊抗小鼠RBCIgG抗體2μL。GVB++稀釋到50μL。不同劑量的CD59功能多肽，加入50μL的正常小鼠血漿96孔板的每個(gè)孔中加入100μL的紅細(xì)胞懸液，然后加入不同稀釋濃度的CD59功能多肽。再加入50μL稀釋過(guò)的羊抗小鼠的單克隆抗體。輕輕混合后，放入37℃水浴箱內(nèi)，溫浴30min，真空離心機(jī)離心后，每孔吸取150μL的液體放入新的96孔板中，讀OD411nm值陽(yáng)性對(duì)照組（完全溶解組）：100μL的紅細(xì)胞懸液中加入100μL的雙蒸水，然后如上讀取OD411nm值。陰性對(duì)照組（無(wú)溶解組）：100μL的紅細(xì)胞懸液加100μLGVB++，然后如上讀取OD411nm值。計(jì)算紅細(xì)胞的溶解率：溶解率（%）=（實(shí)驗(yàn)組OD411nm-陰性對(duì)照組OD411nm）/（陽(yáng)性對(duì)照組411nm-陰性對(duì)照組OD411nm）×100。

1.2.5.2 替代途徑 如上法準(zhǔn)備紅細(xì)胞，原始蛇毒素溶液是1μg/μL，加20μL蛇毒素到4μL GVB++，形成5μg/μL蛇毒素。不同劑量的重組CD59功能多肽，加入50μL的正常小鼠血漿。96孔板的每個(gè)孔中加入100μL的紅細(xì)胞懸液，然后加入50μl的（蛇毒素CVF）到每管，再加入50μL的不同稀釋濃度的重組CD59功能多肽。輕輕的混合后，在37℃水浴箱內(nèi)，溫浴30min，真空離心機(jī)離心后，每孔吸取150μL的液體放入新的96孔板中，讀OD411nm值。參照上述方法建立陽(yáng)性對(duì)照組及陰性對(duì)照組并計(jì)算紅細(xì)胞的溶解率。

2 結(jié)果與分析

2.1 可溶性CD59功能多肽的制備 本次試驗(yàn)成功制備了CD59的功能多肽，分子量大小約18.4KDa，純度較高，見(jiàn)圖2。圖2中，右邊泳道是蛋白質(zhì)marker，左邊泳道是小鼠CD59功能多肽。

圖2 小鼠CD59功能多肽

2.2 生物學(xué)活性鑒定 制備的小鼠CD59功能多肽有效抑制了抗體激活的溶血反應(yīng)（經(jīng)典途徑及替代途徑），可見(jiàn)隨著功能多肽濃度的增加，對(duì)補(bǔ)體激活的溶血反應(yīng)抑制性越強(qiáng)，表現(xiàn)出良好的生物學(xué)活性（見(jiàn)圖3）。

圖3 小鼠CD59功能多肽抑制溶血反應(yīng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3 討論

CD59與人類(lèi)及動(dòng)物的多種疾病密切相關(guān)，最早人們發(fā)現(xiàn)CD59的功能缺陷導(dǎo)致了人類(lèi)陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿（PNH）的產(chǎn)生，CD59缺乏的小鼠表現(xiàn)出明顯的溶血傾向［3］。近期科學(xué)家又發(fā)現(xiàn)CD59缺乏的小鼠中MAC在關(guān)節(jié)中大量沉積，損傷關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞，加速了退變性關(guān)節(jié)炎的產(chǎn)生，扮演了中心性角色［4］。CD59還與T細(xì)胞的信號(hào)傳導(dǎo)密切相關(guān)，調(diào)節(jié)T細(xì)胞的活化［5］，在動(dòng)物免疫系統(tǒng)中扮演了重要的角色。獲得良好結(jié)構(gòu)和功能的CD59蛋白，有助于對(duì)其功能研究工作開(kāi)展進(jìn)一步開(kāi)展。但CD59蛋白具有明顯的種屬特異性，嚙齒目動(dòng)物CD59基因存在2組序列CD59a及CD59b［6］，CD59a分布廣泛，存在各種組織器官中，而CD59b主要存在于嚙齒目動(dòng)物的生殖系統(tǒng)。故針對(duì)嚙齒目動(dòng)物CD59a功能的研究較為廣泛。

CD59是細(xì)胞膜表面結(jié)合蛋白，其通過(guò)GPI共價(jià)結(jié)合于細(xì)胞膜的磷脂雙分子層，研究表明GPI結(jié)構(gòu)在CD59的功能發(fā)揮中起重要作用，但現(xiàn)有的基因工程、蛋白純化的手段獲得大量GPI-錨固蛋白極其困難，目前尚無(wú)簡(jiǎn)單有效、經(jīng)濟(jì)可行的技術(shù)來(lái)實(shí)現(xiàn)。原核細(xì)胞表達(dá)體系具有蛋白質(zhì)表達(dá)量大，表達(dá)穩(wěn)定，條件要求不高及可操作性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，可大量制備蛋白多肽應(yīng)用于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，有利于對(duì)蛋白質(zhì)功能的進(jìn)一步研究。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用大腸桿菌原核表達(dá)體系成功提取了具有較高純度的嚙齒目動(dòng)物小鼠的CD59a的功能部多肽，其不包括與細(xì)胞膜結(jié)合的GPI結(jié)構(gòu)，但包含抑制C8與C9結(jié)合，形成MAC結(jié)構(gòu)的功能部；溶血實(shí)驗(yàn)證實(shí)其可有效的抑制經(jīng)典及替代途徑補(bǔ)體激活的細(xì)胞殺傷效應(yīng)，可見(jiàn)此CD59a功能多肽有良好的補(bǔ)體抑制功效，利用它可進(jìn)行相關(guān)CD59功能的實(shí)驗(yàn)研究，是一個(gè)非常有意義的探索。但CD59功能多肽與GPI結(jié)構(gòu)良好的天然CD59蛋白生物活性可能仍存在一定的差異，需進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)；同時(shí)利用基因工程技術(shù)獲得大量具備良好GPI結(jié)構(gòu)的CD59蛋白值得進(jìn)一步的探討。

參考文獻(xiàn)

［1］Markiewski MM，Lambris JD.The role of complement in inflammatory diseases from behind the scenes into the spotlight［J］.Am J Pathol，2007，171（3）：715-27.

［2］Huang Y，Qiao F，Abagyan R.Defining the CD59-C9 binding interaction［J］.Journal of Biological Chemistry，2006，（37）：27 398-27 404.

［3］Qin X，Hu W，Song W，et al. Balancing role of nitric oxide in complement-mediated activation of platelets from mCd59a and mCd59b double-knockout mice［J］.Am J Hematol，2009，84（4）：221-227.

［4］Wang Q，Rozelle AL，Lepus CM，et al.Identification of a central role for complement in osteoarthritis［J］.Nat Med，2011，17：1 674-1 679.

［5］高美華，秦云，王冰，等.CD59在T細(xì)胞LAT脂筏內(nèi)移位及跨膜信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中的作用［J］.免疫學(xué)雜志，2013，29（4）：301-305.

［6］Qin X，Hu W，Song W，et al.Generation and phenotyping of mCd59a and mCd59b double-knockout mice［J］.Am J Hematol，2009，84（2）：65-70.

（責(zé)編：張宏民）

1.2.5.2 替代途徑 如上法準(zhǔn)備紅細(xì)胞，原始蛇毒素溶液是1μg/μL，加20μL蛇毒素到4μL GVB++，形成5μg/μL蛇毒素。不同劑量的重組CD59功能多肽，加入50μL的正常小鼠血漿。96孔板的每個(gè)孔中加入100μL的紅細(xì)胞懸液，然后加入50μl的（蛇毒素CVF）到每管，再加入50μL的不同稀釋濃度的重組CD59功能多肽。輕輕的混合后，在37℃水浴箱內(nèi)，溫浴30min，真空離心機(jī)離心后，每孔吸取150μL的液體放入新的96孔板中，讀OD411nm值。參照上述方法建立陽(yáng)性對(duì)照組及陰性對(duì)照組并計(jì)算紅細(xì)胞的溶解率。

2 結(jié)果與分析

2.1 可溶性CD59功能多肽的制備 本次試驗(yàn)成功制備了CD59的功能多肽，分子量大小約18.4KDa，純度較高，見(jiàn)圖2。圖2中，右邊泳道是蛋白質(zhì)marker，左邊泳道是小鼠CD59功能多肽。

圖2 小鼠CD59功能多肽

2.2 生物學(xué)活性鑒定 制備的小鼠CD59功能多肽有效抑制了抗體激活的溶血反應(yīng)（經(jīng)典途徑及替代途徑），可見(jiàn)隨著功能多肽濃度的增加，對(duì)補(bǔ)體激活的溶血反應(yīng)抑制性越強(qiáng)，表現(xiàn)出良好的生物學(xué)活性（見(jiàn)圖3）。

圖3 小鼠CD59功能多肽抑制溶血反應(yīng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3 討論

CD59與人類(lèi)及動(dòng)物的多種疾病密切相關(guān)，最早人們發(fā)現(xiàn)CD59的功能缺陷導(dǎo)致了人類(lèi)陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿（PNH）的產(chǎn)生，CD59缺乏的小鼠表現(xiàn)出明顯的溶血傾向［3］。近期科學(xué)家又發(fā)現(xiàn)CD59缺乏的小鼠中MAC在關(guān)節(jié)中大量沉積，損傷關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞，加速了退變性關(guān)節(jié)炎的產(chǎn)生，扮演了中心性角色［4］。CD59還與T細(xì)胞的信號(hào)傳導(dǎo)密切相關(guān)，調(diào)節(jié)T細(xì)胞的活化［5］，在動(dòng)物免疫系統(tǒng)中扮演了重要的角色。獲得良好結(jié)構(gòu)和功能的CD59蛋白，有助于對(duì)其功能研究工作開(kāi)展進(jìn)一步開(kāi)展。但CD59蛋白具有明顯的種屬特異性，嚙齒目動(dòng)物CD59基因存在2組序列CD59a及CD59b［6］，CD59a分布廣泛，存在各種組織器官中，而CD59b主要存在于嚙齒目動(dòng)物的生殖系統(tǒng)。故針對(duì)嚙齒目動(dòng)物CD59a功能的研究較為廣泛。

CD59是細(xì)胞膜表面結(jié)合蛋白，其通過(guò)GPI共價(jià)結(jié)合于細(xì)胞膜的磷脂雙分子層，研究表明GPI結(jié)構(gòu)在CD59的功能發(fā)揮中起重要作用，但現(xiàn)有的基因工程、蛋白純化的手段獲得大量GPI-錨固蛋白極其困難，目前尚無(wú)簡(jiǎn)單有效、經(jīng)濟(jì)可行的技術(shù)來(lái)實(shí)現(xiàn)。原核細(xì)胞表達(dá)體系具有蛋白質(zhì)表達(dá)量大，表達(dá)穩(wěn)定，條件要求不高及可操作性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，可大量制備蛋白多肽應(yīng)用于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，有利于對(duì)蛋白質(zhì)功能的進(jìn)一步研究。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用大腸桿菌原核表達(dá)體系成功提取了具有較高純度的嚙齒目動(dòng)物小鼠的CD59a的功能部多肽，其不包括與細(xì)胞膜結(jié)合的GPI結(jié)構(gòu)，但包含抑制C8與C9結(jié)合，形成MAC結(jié)構(gòu)的功能部；溶血實(shí)驗(yàn)證實(shí)其可有效的抑制經(jīng)典及替代途徑補(bǔ)體激活的細(xì)胞殺傷效應(yīng)，可見(jiàn)此CD59a功能多肽有良好的補(bǔ)體抑制功效，利用它可進(jìn)行相關(guān)CD59功能的實(shí)驗(yàn)研究，是一個(gè)非常有意義的探索。但CD59功能多肽與GPI結(jié)構(gòu)良好的天然CD59蛋白生物活性可能仍存在一定的差異，需進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)；同時(shí)利用基因工程技術(shù)獲得大量具備良好GPI結(jié)構(gòu)的CD59蛋白值得進(jìn)一步的探討。

參考文獻(xiàn)

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［2］Huang Y，Qiao F，Abagyan R.Defining the CD59-C9 binding interaction［J］.Journal of Biological Chemistry，2006，（37）：27 398-27 404.

［3］Qin X，Hu W，Song W，et al. Balancing role of nitric oxide in complement-mediated activation of platelets from mCd59a and mCd59b double-knockout mice［J］.Am J Hematol，2009，84（4）：221-227.

［4］Wang Q，Rozelle AL，Lepus CM，et al.Identification of a central role for complement in osteoarthritis［J］.Nat Med，2011，17：1 674-1 679.

［5］高美華，秦云，王冰，等.CD59在T細(xì)胞LAT脂筏內(nèi)移位及跨膜信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中的作用［J］.免疫學(xué)雜志，2013，29（4）：301-305.

［6］Qin X，Hu W，Song W，et al.Generation and phenotyping of mCd59a and mCd59b double-knockout mice［J］.Am J Hematol，2009，84（2）：65-70.

（責(zé)編：張宏民）

1.2.5.2 替代途徑 如上法準(zhǔn)備紅細(xì)胞，原始蛇毒素溶液是1μg/μL，加20μL蛇毒素到4μL GVB++，形成5μg/μL蛇毒素。不同劑量的重組CD59功能多肽，加入50μL的正常小鼠血漿。96孔板的每個(gè)孔中加入100μL的紅細(xì)胞懸液，然后加入50μl的（蛇毒素CVF）到每管，再加入50μL的不同稀釋濃度的重組CD59功能多肽。輕輕的混合后，在37℃水浴箱內(nèi)，溫浴30min，真空離心機(jī)離心后，每孔吸取150μL的液體放入新的96孔板中，讀OD411nm值。參照上述方法建立陽(yáng)性對(duì)照組及陰性對(duì)照組并計(jì)算紅細(xì)胞的溶解率。

2 結(jié)果與分析

2.1 可溶性CD59功能多肽的制備 本次試驗(yàn)成功制備了CD59的功能多肽，分子量大小約18.4KDa，純度較高，見(jiàn)圖2。圖2中，右邊泳道是蛋白質(zhì)marker，左邊泳道是小鼠CD59功能多肽。

圖2 小鼠CD59功能多肽

2.2 生物學(xué)活性鑒定 制備的小鼠CD59功能多肽有效抑制了抗體激活的溶血反應(yīng)（經(jīng)典途徑及替代途徑），可見(jiàn)隨著功能多肽濃度的增加，對(duì)補(bǔ)體激活的溶血反應(yīng)抑制性越強(qiáng)，表現(xiàn)出良好的生物學(xué)活性（見(jiàn)圖3）。

圖3 小鼠CD59功能多肽抑制溶血反應(yīng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3 討論

CD59與人類(lèi)及動(dòng)物的多種疾病密切相關(guān)，最早人們發(fā)現(xiàn)CD59的功能缺陷導(dǎo)致了人類(lèi)陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿（PNH）的產(chǎn)生，CD59缺乏的小鼠表現(xiàn)出明顯的溶血傾向［3］。近期科學(xué)家又發(fā)現(xiàn)CD59缺乏的小鼠中MAC在關(guān)節(jié)中大量沉積，損傷關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞，加速了退變性關(guān)節(jié)炎的產(chǎn)生，扮演了中心性角色［4］。CD59還與T細(xì)胞的信號(hào)傳導(dǎo)密切相關(guān)，調(diào)節(jié)T細(xì)胞的活化［5］，在動(dòng)物免疫系統(tǒng)中扮演了重要的角色。獲得良好結(jié)構(gòu)和功能的CD59蛋白，有助于對(duì)其功能研究工作開(kāi)展進(jìn)一步開(kāi)展。但CD59蛋白具有明顯的種屬特異性，嚙齒目動(dòng)物CD59基因存在2組序列CD59a及CD59b［6］，CD59a分布廣泛，存在各種組織器官中，而CD59b主要存在于嚙齒目動(dòng)物的生殖系統(tǒng)。故針對(duì)嚙齒目動(dòng)物CD59a功能的研究較為廣泛。

CD59是細(xì)胞膜表面結(jié)合蛋白，其通過(guò)GPI共價(jià)結(jié)合于細(xì)胞膜的磷脂雙分子層，研究表明GPI結(jié)構(gòu)在CD59的功能發(fā)揮中起重要作用，但現(xiàn)有的基因工程、蛋白純化的手段獲得大量GPI-錨固蛋白極其困難，目前尚無(wú)簡(jiǎn)單有效、經(jīng)濟(jì)可行的技術(shù)來(lái)實(shí)現(xiàn)。原核細(xì)胞表達(dá)體系具有蛋白質(zhì)表達(dá)量大，表達(dá)穩(wěn)定，條件要求不高及可操作性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，可大量制備蛋白多肽應(yīng)用于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，有利于對(duì)蛋白質(zhì)功能的進(jìn)一步研究。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用大腸桿菌原核表達(dá)體系成功提取了具有較高純度的嚙齒目動(dòng)物小鼠的CD59a的功能部多肽，其不包括與細(xì)胞膜結(jié)合的GPI結(jié)構(gòu)，但包含抑制C8與C9結(jié)合，形成MAC結(jié)構(gòu)的功能部；溶血實(shí)驗(yàn)證實(shí)其可有效的抑制經(jīng)典及替代途徑補(bǔ)體激活的細(xì)胞殺傷效應(yīng)，可見(jiàn)此CD59a功能多肽有良好的補(bǔ)體抑制功效，利用它可進(jìn)行相關(guān)CD59功能的實(shí)驗(yàn)研究，是一個(gè)非常有意義的探索。但CD59功能多肽與GPI結(jié)構(gòu)良好的天然CD59蛋白生物活性可能仍存在一定的差異，需進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)；同時(shí)利用基因工程技術(shù)獲得大量具備良好GPI結(jié)構(gòu)的CD59蛋白值得進(jìn)一步的探討。

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（責(zé)編：張宏民）