李政懋+呂辰+楊選鑫+張宏宇

（溫州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院分子藥理研究中心 溫州 325035）

摘 要 目的：探究外源NGF對(duì)大鼠創(chuàng)面的治療作用及機(jī)制。方法：在SD雄性大鼠的背部脊柱的兩側(cè)手術(shù)切開形成兩個(gè)2 cm x 2 cm的傷口，右邊傷口處給予20 mg/ml NGF 1 ml，左邊傷口給等量生理鹽水作為對(duì)照組。隔天給藥到第14天（第14天停止給藥），分別于d3、d7、d14統(tǒng)計(jì)創(chuàng)面?zhèn)谟下?，并取這3個(gè)時(shí)間點(diǎn)的組織用免疫組化的方法檢測(cè)轉(zhuǎn)化生長因子 （ transforming growth factor-β1，TGF-β1）、CD68-陽性巨噬細(xì)胞、增殖性細(xì)胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）、血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF-1）的表達(dá)量。結(jié)果：NGF組的創(chuàng)面愈合率明顯高于生理鹽水組，并且NGF組TGF-β1、CD68、PCNA、VEGF-1的蛋白表達(dá)量也顯著高于生理鹽水組（P<0.05）。結(jié)論：外源NGF具有促進(jìn)創(chuàng)面愈合作用，其機(jī)制可能與趨化炎癥因子、加快血管生成、促進(jìn)PCNA、TGF-β1的表達(dá)相關(guān)。

關(guān)鍵詞 神經(jīng)生長因子 創(chuàng)面修復(fù) 炎癥趨化因子 血管生成 細(xì)胞增殖

中圖分類號(hào)：R628 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1006-1533（2014）17-0051-04

Study on the mechanism of exogenous nerve growth factor

in accelerating the wound healing in the model of rats with skin damage

LI Zhengmao， LV Chen， YANG Xuanxin， ZHANG Hongyu*

（The Institute of Molecular Pharmacology， Wenzhou Medical University， Wenzhou 325035， China）

ABSTRACT Objective： To study the therapeutic effect of nerve growth factor （NGF） on wound healing in rats and its mechanism. Methods： Two full thickness wounds （2 cm x 2 cm） extending through the panniculus carnosus were made on both sides of the back spine in SD male rats. The right incision （designated as an experimental group） was treated with 1 ml of NGF （20 mg/ml， dissolved in 0.9% sterile saline） every other day till 14th days while the left incision （designated as a control group） with equal amounts of 0.9% sterile saline. The rates of wound healing were recorded at day 3， 7 and 14 and the expression of transforming growth factor-β1 （TGF-β1）， CD68+ macrophages， proliferating cell nuclear antigen （PCNA） and vascular endothelial growth factor （VEGF-1） in wound tissues sampled at day 3，7 and 14 were detected by immunohistochemistry staining. Results： The rates of wound healing and the protein expression of TGF-β1、CD68、PCNA、VEGF-1 were obviously higher in the experimental group than in the control group （P<0.05）. Conclusion： The mechanism of NGF in the promotion of wound healing might be related to the chemotactic factor， the promotion of angiogenesis and the expression of PCNA and TGF-β1.

KEY WORDS nerve growth factor； wounds healing； chemotactic factors； vasculogenesis； cell proliferation

神經(jīng)生長因子（NGF）最早于1953年被Levi-Montalcini發(fā)現(xiàn)，并因此獲得了1986年諾貝爾醫(yī)學(xué)生理學(xué)獎(jiǎng)。目前多用的是鼠源性NGF，包含a、b、g 3個(gè)亞單位，活性區(qū)是b亞單位，由兩個(gè)118個(gè)氨基酸組成的單鏈通過非共價(jià)鍵結(jié)合而成的二聚體[1] 。研究發(fā)現(xiàn)NGF具有：①促進(jìn)神經(jīng)元分化再生[2] ；②維持神經(jīng)元的存活、生長、發(fā)育，尤其是對(duì)多巴胺能神經(jīng)元的保護(hù)作用；③促進(jìn)神經(jīng)元的修復(fù)[3] ；④促進(jìn)創(chuàng)口的表皮細(xì)胞、真皮細(xì)胞的生長，使其修復(fù)愈合[4] 。

皮膚創(chuàng)傷是一個(gè)復(fù)雜的病理過程，包括炎癥反應(yīng)、細(xì)胞增殖、創(chuàng)面收縮、膠原代謝、新生血管形成及增殖、感覺末梢神經(jīng)的恢復(fù)等基本過程，臨床表現(xiàn)為局部炎癥反應(yīng)、細(xì)胞增殖分化及肉芽組織形成、組織重建三個(gè)階段[5] 。大量研究證實(shí)：創(chuàng)面愈合的各階段均有NGF參與并發(fā)揮重要作用。本研究將通過構(gòu)建大鼠皮膚創(chuàng)傷實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，給予外源NGF治療，在不同的時(shí)間點(diǎn)統(tǒng)計(jì)傷口愈合率，通過免疫組化染色對(duì)TGF-β1、CD68、PCNA、VEGF-1的蛋白表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)分析，探討NGF促進(jìn)皮膚創(chuàng)傷修復(fù)的相關(guān)機(jī)制。

材料與方法

材料

SPF級(jí)成年雄性SD大鼠30只，體重200～250 g，購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心（醫(yī)動(dòng)字第04-20-3號(hào)）。UltraSensitiveTM S-P 超敏試劑盒（福州邁新，產(chǎn)品編號(hào)：KIT-9710）。外源性NGF由廈門北大之路生物科技有限公司提供。

方法

動(dòng)物模型的建立

用8%的水合氯醛對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠經(jīng)腹腔注射進(jìn)行麻醉，麻醉后固定于簡易操作臺(tái)，剪去背部毛發(fā)，用碘伏對(duì)背部皮膚進(jìn)行消毒。用剪刀在其背部以脊柱為對(duì)稱軸的兩側(cè)剪兩個(gè)2 cm x 2 cm的傷口。右側(cè)傷口給20 mg/ml NGF 1 ml，左側(cè)給予等量的無菌生理鹽水（0.9%氯化鈉溶液）。隔天給藥到第14天（第14天不給藥）。

創(chuàng)面愈合率的統(tǒng)計(jì)

分別于d1、d3、d7和d14量取傷口未愈合面積（用透明的紙畫下傷口面積，再將畫下的面積復(fù)印到坐標(biāo)紙上，數(shù)格計(jì)算出面積），計(jì)算比較傷口愈合率。傷口愈合率（%）=（開始時(shí)傷口面積-取材日傷口面積）/開始時(shí)傷口面積×100%[6] 。

皮膚組織處理

1）于d3、d7各處死5只大鼠，d14處理全部大鼠，取其背上創(chuàng)面的全層皮膚，進(jìn)行石蠟包埋處理，切片厚度為7 mm。

2）通過免疫組化將已經(jīng)包埋好的組織切片進(jìn)行染色檢測(cè)，依次經(jīng)過二甲苯及不同濃度梯度的酒精進(jìn)行脫蠟后，在清水中沖洗一段時(shí)間，加入3% H2O2浸泡10 min，除去內(nèi)源性的過氧化氫酶后再加入檸檬酸緩沖液，放入微波爐中加熱3 min（溫度：95 ℃左右），使抗原的位點(diǎn)暴露出來，冷卻至室溫后進(jìn)行血清封閉。再依次進(jìn)行加一抗、二抗、SABC和由DAB/H2O2/磷酸緩沖液配置的染色液處理。隨后加入蘇木精中復(fù)染，脫水后進(jìn)行封片，檢測(cè)TGF-β1、CD68、PCNA、VEGF-1的蛋白表達(dá)量，根據(jù)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)一步對(duì)NGF是否有促進(jìn)創(chuàng)面愈合作用作出判定[7-10] 。

結(jié)果

創(chuàng)面愈合率

NGF組與生理鹽水組在d1、d3、d7、d14的皮膚愈合率見表1，其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），表明外源NGF能夠加速創(chuàng)面的愈合。

TGF-β1、CD68、PCNA、VEGF-1的蛋白表達(dá)量

TGF-β1是一族多肽類生長因子，可以作用于成纖維細(xì)胞，促進(jìn)細(xì)胞增殖分化，抑制細(xì)胞凋亡，合成膠原蛋白，并調(diào)節(jié)創(chuàng)傷中各細(xì)胞間的相互作用，加速創(chuàng)面的愈合[7]。TGF-β1抗原表達(dá)多少與細(xì)胞增殖成正相關(guān)，可以反映出細(xì)胞的增殖狀態(tài)。由此推斷NGF能促進(jìn)細(xì)胞增殖，從而促進(jìn)傷口愈合（圖1）。

CD68是主要的單核-巨噬細(xì)胞抗原，其表達(dá)可以反應(yīng)出巨噬細(xì)胞的分布，推測(cè)NGF可以誘導(dǎo)炎癥細(xì)胞在創(chuàng)面的聚集（圖1）。

PCNA陽性表達(dá)的強(qiáng)弱代表細(xì)胞增殖活動(dòng)的高低，在細(xì)胞增殖的啟動(dòng)上起著重要作用，是目前能較好反映細(xì)胞增殖狀況的指標(biāo)[8]。表明NGF有利于傷口的愈合（圖1）。

VEGF-1作為一種血管生成調(diào)節(jié)因子，在創(chuàng)傷早期的大量表達(dá)有助于傷口的愈合[9-10]。推斷NGF可以促進(jìn)VEGF-1表達(dá)，使創(chuàng)面處的血管細(xì)胞處于增殖狀態(tài)，從而加快傷口的愈合（圖1）。

討論

創(chuàng)傷愈合是一個(gè)涉及分子、細(xì)胞和組織水平的復(fù)雜生物學(xué)過程。在創(chuàng)面組織損傷修復(fù)過程中，細(xì)胞因子幾乎調(diào)控?fù)p傷后皮膚再生的全過程，包括細(xì)胞趨化、增殖、基質(zhì)合成與降解、炎癥反應(yīng)等多方面。TGF-β1作為一種大分子復(fù)合體作用于成纖維細(xì)胞，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生并抑制其降解，對(duì)細(xì)胞增殖、分化起重要調(diào)節(jié)作用[11]。CD68在傷口炎癥反應(yīng)階段主要是趨化、聚集炎癥細(xì)胞，并清除壞死組織及細(xì)胞碎片[12] 。PCNA可促細(xì)胞增殖，并在細(xì)胞生長S期大量表達(dá)，故可將其作為評(píng)價(jià)細(xì)胞增殖狀態(tài)的重要指標(biāo)[13] 。VEGF-1可直接作用血管內(nèi)皮細(xì)胞，加強(qiáng)血管通透功能，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖而形成新血管[14-15] 。以上4種蛋白的作用均在創(chuàng)傷愈合過程中有重大意義。

NGF作為一種神經(jīng)生長因子，與堿性成纖維細(xì)胞生長因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）都是多功能的生物活性多肽，目前在臨床創(chuàng)面修復(fù)治療中，bFGF凍干粉已經(jīng)成為一種重要的生物治療藥物。有文獻(xiàn)報(bào)道，在切斷成年大鼠的坐骨神經(jīng)后，坐骨神經(jīng)斷端吻合口處會(huì)立刻觀察到內(nèi)源性NGF大量表達(dá)[5，16] ，表明NGF也會(huì)參與細(xì)胞的再生修復(fù)及傷口愈合的過程。由此推測(cè)NGF在創(chuàng)面愈合方面具有與bFGF相似的生物學(xué)效應(yīng)[17]。為進(jìn)一步探究NGF對(duì)皮膚創(chuàng)傷愈合的修復(fù)機(jī)制，本研究通過外源給予創(chuàng)傷模型NGF，并于不同的時(shí)間點(diǎn)對(duì)創(chuàng)面的愈合情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，發(fā)現(xiàn)NGF組的愈合情況要明顯好于生理鹽水組，但需要考慮到的一點(diǎn)是，大鼠皮膚與人體皮膚存在著差異，相對(duì)而言大鼠對(duì)皮膚創(chuàng)面具有更強(qiáng)的修復(fù)作用，因此在表1中，NGF組與生理鹽水組在d14都有較好的愈合效果。但總體而言，給予NGF后能夠顯著提高創(chuàng)面修復(fù)能力。本文實(shí)驗(yàn)還分別對(duì)TGF-β1、CD68、PCNA、VEGF-1的表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)TGF-β1在d3、d7的表達(dá)量明顯高于生理鹽水組，愈合完全后（d14）表達(dá)量有所下降，原因可能是由于NGF組在d14已經(jīng)達(dá)到幾乎完全愈合的效果，因此TGF-β1的表達(dá)量有所下降，而生理鹽水組在d14并未達(dá)到完全愈合效果，所以TGF-β1的表達(dá)量仍處于一個(gè)相對(duì)較高的水平。同樣地，NGF組的CD68、PCNA、VEGF-1的表達(dá)量在d3、d7也顯著高于生理鹽水組，并在d14相對(duì)低于生理鹽水組，這表明了NGF的給予會(huì)促進(jìn)這4種蛋白的表達(dá)，從而達(dá)到加快傷口愈合的生物學(xué)效應(yīng)。另外發(fā)現(xiàn)給予NGF后，PCNA在d3的表達(dá)要高于d7，推測(cè)其原因?yàn)榇笫笃つw出現(xiàn)創(chuàng)面時(shí)，其機(jī)體自身會(huì)即刻通過不同的細(xì)胞增殖來進(jìn)行創(chuàng)面的修復(fù)，因而在d3其表達(dá)量較高。而NGF促進(jìn)創(chuàng)面愈合的作用很有可能與促進(jìn)膠原蛋白的沉積、血管的生成、加速傷口處的血液循環(huán)，使氧和營養(yǎng)物質(zhì)能夠到達(dá)傷口部位，讓細(xì)胞得到充分的增殖，為傷口愈合提供有利的條件等有關(guān)，其具體機(jī)制仍有待于進(jìn)一步的研究探明。

由此可見，NGF在創(chuàng)面修復(fù)中潛在的應(yīng)用價(jià)值正在漸漸的凸顯出來。繼續(xù)探究NGF對(duì)創(chuàng)面愈合的修復(fù)機(jī)制，更好地利用NGF自身的生物學(xué)特點(diǎn)，將是今后研究的一個(gè)重點(diǎn)和方向，也將為臨床治療難愈創(chuàng)面提供新的策略。

參考文獻(xiàn)

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（收稿日期：2014-06-10）

由此可見，NGF在創(chuàng)面修復(fù)中潛在的應(yīng)用價(jià)值正在漸漸的凸顯出來。繼續(xù)探究NGF對(duì)創(chuàng)面愈合的修復(fù)機(jī)制，更好地利用NGF自身的生物學(xué)特點(diǎn)，將是今后研究的一個(gè)重點(diǎn)和方向，也將為臨床治療難愈創(chuàng)面提供新的策略。

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（收稿日期：2014-06-10）

由此可見，NGF在創(chuàng)面修復(fù)中潛在的應(yīng)用價(jià)值正在漸漸的凸顯出來。繼續(xù)探究NGF對(duì)創(chuàng)面愈合的修復(fù)機(jī)制，更好地利用NGF自身的生物學(xué)特點(diǎn)，將是今后研究的一個(gè)重點(diǎn)和方向，也將為臨床治療難愈創(chuàng)面提供新的策略。

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（收稿日期：2014-06-10）