楊朝勃　王春　劉成招　林永綏

[摘要] 目的 探討Nogo受體拮抗劑NEP1-40對(duì)大鼠脊髓損傷后，對(duì)神經(jīng)生長因子（NGF）蛋白表達(dá)的影響。 方法 取雌性SD大鼠，隨機(jī)分成對(duì)照組、生理鹽水治療組和NEP1-40治療組，每組10只。建立T10節(jié)段的大鼠脊髓半切損傷模型，分別注射生理鹽水和NEP1-40；于術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)各組大鼠行后肢運(yùn)動(dòng)功能BBB評(píng)分；免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)神經(jīng)生長因子（NGF）的表達(dá)。 結(jié)果 術(shù)后3周時(shí)，NEP1-40治療組的BBB評(píng)分高于生理鹽水治療組（P<0.05）；術(shù)后4周時(shí)，NEP1-40治療組的BBB評(píng)分高于生理鹽水治療組（P<0.01）。與生理鹽水治療組相比，NEP1-40治療組在治療2周后的神經(jīng)生長因子（NGF）蛋白表達(dá)水平較高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。 結(jié)論 脊髓損傷后，NEP1-40可以增加神經(jīng)生長因子（NGF）蛋白的表達(dá)，促進(jìn)脊髓損傷后大鼠神經(jīng)的再生。

[關(guān)鍵詞] 脊髓損傷；Nogo受體拮抗劑；神經(jīng)生長因子；再生

[中圖分類號(hào)] R722.1 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-9701（2015）32-0027-03

[Abstract] Objective To discuss the effect of NEP1-40 on the expression of NGF in rats with spinal cord injury （SCI）. Methods 30 healthy adult Sprague-Dawley rats were randomly divided into model control normal group（n=10）， saline treatment group（n=10） and NEP1-40 treatment group （n=10）. Establish the model of acute spinal cord injury in T10. Injection of saline and NEP1-40 respectively. At different time points after operation， 5 rats in each group were assessed with Basso-Beattie-Bresnahan（BBB） scale， and the expression of Nerve Growth Factor of the spinal cord were detected with immunohistochemistry. Results The scores of BBB were better in NEP1-40 treatment group than in normal saline treatment group 3 weeks after SCI（P<0.05）， The scores of BBB were better in NEP1-40 treatment group than in normal saline treatment group 4 weeks after SCI （P<0.01）. Compared with normal saline treatment group， the expression of NGF increased 2 weeks after SCI in NEP1-40 treatment group（P<0.05）. Conclusion NEP1-40 may promote the expression of NGF in spinal cord after SCI in order to improve neural regeneration in rats.

[Key words] Spinal cord injury； Nogo receptor antagonist； Nerve growth factor； Regeneration

脊髓損傷（spinal cord injury，SCI）是一種致殘與致死率很高的疾病，其治療一直是神經(jīng)損傷修復(fù)領(lǐng)域的難題[1]。Nogo蛋白是目前所知有效的神經(jīng)軸突生長的抑制因子[2]。Nogo受體拮抗劑（Nogo extra cellular peptide，residues1-40，NEP1-40）是Nogo受體（Nogo receptor，NgR）競(jìng)爭(zhēng)性拮抗劑，能拮抗中樞神經(jīng)抑制因子與Nogo受體的結(jié)合，間接促進(jìn)新生軸突的生長，是目前國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)[3]。本研究主要觀察大鼠急性脊髓損傷后NEP1-40對(duì)運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)的影響及對(duì)神經(jīng)生長因子（NGF）蛋白表達(dá)的影響，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

重量200 g左右健康SD（Sprague-Dawley）雌性大鼠30只，隨機(jī)分成生理鹽水治療組（A組），NEP1-40治療組（B組）和對(duì)照組（C組）。動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK（滬）2008000513655，由福建醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，研究時(shí)間2014年9月～2015年7月。

1.2 藥品與試劑

Nogo受體拮抗劑NEP1-40：購自上海信裕生物科技有限公司。免疫組化試劑：兔抗人神經(jīng)生長因子（NGF）相應(yīng)抗體均購自于上海麗臣生物科技有限公司。

1.3 儀器

光學(xué)顯微鏡（Olympus，SZ61，日本），低溫高速離心機(jī)（Thermo Sorvall RC-6 plus，美國），Image-Pro Plus 6.0計(jì)算機(jī)圖像分析系統(tǒng)，超凈工作臺(tái)（SW-CJ-1B，蘇州安泰），電子天平（Sartouris，M371137，德國）。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 脊髓損傷模型制備 采用10%水合氯醛（300 mg/kg）腹腔注射麻醉，切開皮膚、皮下組織，暴露脊柱，以T8棘突為中心，打開T8椎板，做T10脊髓的后半橫斷，損傷深度1.0 mm。置入硬脊膜下導(dǎo)管，固定導(dǎo)管，逐層縫合，模型制作完成。NEP1-40治療組每天將NEP1-40 10 μL（0.4 μg/μL）通過導(dǎo)管注入蛛網(wǎng)膜下腔，連續(xù)注射4周，早、中、晚各一次，注射完后用10 μL生理鹽水沖管，使藥物完全進(jìn)入蛛網(wǎng)膜下腔。術(shù)后前3 d注射青霉素4萬U/只，防止感染。術(shù)后每日擠壓膀胱，促使排尿，直至排尿反射形成。生理鹽水治療組每天注入生理鹽水20 μL，對(duì)照組切開皮膚后縫合，未干預(yù)。

1.4.2 標(biāo)本收集和切片制作 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均于脊髓損傷后第1、2、3、4周時(shí)打開胸腔，經(jīng)心臟灌注緩沖液沖洗組織內(nèi)血液。取出脊髓組織，在4%多聚甲醛中固定約6 h，以30%蔗糖溶液浸泡，冰凍切片，厚度20 μm。

1.5 評(píng)價(jià)指標(biāo)

1.5.1 后肢運(yùn)動(dòng)神經(jīng)功能 評(píng)分用BBB評(píng)分法[4]于術(shù)后1 d、3 d、1周、2周、3周、4周觀察大鼠雙后肢運(yùn)動(dòng)功能，并按后肢全癱（0分）至后肢運(yùn)動(dòng)完全正常（21分）記錄分?jǐn)?shù)。

1.5.2 NGF蛋白表達(dá)的免疫組織化學(xué)方法及步驟 免疫組織化學(xué)染色嚴(yán)格按照試劑盒操作，每只大鼠隨機(jī)5張切片。觀察與計(jì)數(shù)方法：以胞質(zhì)或胞核中出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性，以Image-Pro Plus 6.0軟件計(jì)算每張切片的陽性細(xì)胞數(shù)，該標(biāo)本的陽性細(xì)胞數(shù)為每張片的平均陽性細(xì)胞個(gè)數(shù)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料用（x±s）表示，進(jìn)行單因素方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 行為學(xué)觀察

術(shù)后脊髓損傷的大鼠均呈現(xiàn)雙后肢完全癱瘓，術(shù)后1周時(shí)，手術(shù)組大鼠后肢功能無明顯恢復(fù)，隨著觀察時(shí)間延長，手術(shù)組動(dòng)物的神經(jīng)功能均有不同程度的恢復(fù)。術(shù)后1 d～2周，BBB評(píng)分NEP1-40治療組（B組）與生理鹽水治療組（A組）組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；術(shù)后3周時(shí)，B組的BBB評(píng)分顯著高于A組（P<0.05）；術(shù)后4周時(shí)，B組的BBB評(píng)分顯著高于A組（P<0.05）。見表1。

2.2 NGF蛋白的表達(dá)

在第1周時(shí)，生理鹽水治療組（A組）與NEP1-40治療組（B組）NGF蛋白表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；與A組相比，B組在第2、3、4周的NGF蛋白表達(dá)水平較高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；與C組相比，A組、B組在不同時(shí)相點(diǎn)NGF蛋白表達(dá)水平明顯降低，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。見封三圖1～封三圖8、表2。

3 討論

目前脊髓損傷的發(fā)病率正在逐年增加，對(duì)人們的健康和生活質(zhì)量構(gòu)成了重大的威脅。具有致殘率高、花費(fèi)高，病死率高的特點(diǎn)[5]。目前治療脊髓損傷的主要方法有藥物治療和手術(shù)干預(yù)等，雖然有一定的療效，但療效甚微?；颊卟粌H身心健康受到影響，也造成社會(huì)經(jīng)濟(jì)問題。

脊髓損傷后局部環(huán)境改變導(dǎo)致神經(jīng)缺血、變性。脊髓軸突的再生由于髓磷脂被破壞、膠質(zhì)細(xì)胞丟失等原因受到影響，脊髓損傷后難以恢復(fù)主要由于軸突再生抑制[6]。髓磷脂相關(guān)糖蛋白、少突膠質(zhì)細(xì)胞髓磷脂糖蛋白、Nogo蛋白是三種目前已知的神經(jīng)軸突再生抑制因子[7]。Nogo基因能夠表達(dá)三種網(wǎng)狀蛋白。三種蛋白均作用于共同的受體NgR（Nogo receptor，NgR），NgR是抑制某些神經(jīng)軸突生長因子的關(guān)鍵靶點(diǎn)。NgR至少有3個(gè)亞單位構(gòu)成，被激活后有阻止神經(jīng)軸突生長的作用[8]。當(dāng)作為結(jié)合體三種蛋白與NgR相結(jié)合，可以激活Rho-A，中止生長錐使神經(jīng)軸突的生長受到抑制[9]。表達(dá)在神經(jīng)元軸突中的Nogo-A分子質(zhì)量大且是其中作用最重要的蛋白，Nogo-A抑制神經(jīng)軸突生長，功能區(qū)由66個(gè)氨基酸組成，是發(fā)揮抑制作用的主要功能結(jié)構(gòu)區(qū)。與位于神經(jīng)軸突細(xì)胞膜表面的Nogo-66受體結(jié)合后，通過信號(hào)傳導(dǎo)抑制神經(jīng)軸突再生[10]。由Nogo基因表達(dá)的蛋白質(zhì)產(chǎn)物與NgR復(fù)合物，是目前被世人認(rèn)可的神經(jīng)軸突生長抑制因子，在人的脊髓等部位的研究有所進(jìn)展[11，12]。

NEP1-40是目前有效的NgR受體的競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑，同時(shí)具有營養(yǎng)神經(jīng)的作用。GrandPré等[13]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，NEP1-40可以和NgR受體結(jié)合，使抑制神經(jīng)軸突生長NgR受體的下游信號(hào)通路塌陷，從而促使脊髓損傷后軸突生長。

NGF是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的典型的細(xì)胞因子，對(duì)神經(jīng)軸突的生長具有重要的作用[14]。NGF通過與膜上的受體結(jié)合，通過信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)發(fā)揮活性，同時(shí)具有營養(yǎng)神經(jīng)的作用。當(dāng)脊髓損傷后，神經(jīng)系統(tǒng)會(huì)產(chǎn)生神經(jīng)營養(yǎng)因子，以NGF作用尤為突出，從而對(duì)神經(jīng)元的正常功能和結(jié)構(gòu)進(jìn)行維持和保護(hù)。機(jī)制可能是通過細(xì)胞內(nèi)分泌和細(xì)胞旁分泌的形式，刺激軸突生長，在神經(jīng)系統(tǒng)的修復(fù)中發(fā)揮不可替代的作用[15]。

本實(shí)驗(yàn)中，術(shù)后3周，NEP1-40治療組BBB評(píng)分較生理鹽水治療組高（P<0.05）。術(shù)后4周，NEP1-40治療組BBB評(píng)分較生理鹽水治療組高（P<0.01）。NEP1-40治療組比生理鹽水治療組有更好的神經(jīng)功能的恢復(fù)，說明NEP1-40治療后的大鼠受損中樞神經(jīng)系統(tǒng)軸突的生長及功能恢復(fù)更加有效?？赡躈EP1-40在脊髓損傷恢復(fù)中除了促進(jìn)軸突生長以外，尚有其他作用。通過對(duì)NGF表達(dá)的免疫組化分析，術(shù)后1周NEP1-40治療組與生理鹽水治療組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。術(shù)后2周后，NEP1-40治療組陽性細(xì)胞數(shù)目多于生理鹽水治療組（P<0.05）。說明NEP1-40能促進(jìn)脊髓神經(jīng)元的生長。NEP1-40在大鼠脊髓損傷模型中的蛛網(wǎng)膜下腔的給藥，導(dǎo)致了神經(jīng)軸突的生長，促進(jìn)了大鼠脊髓損傷后雙下肢運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)。因此，Nogo蛋白與NgR為中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后神經(jīng)軸突生長受到阻礙的主要結(jié)構(gòu)。而NEP1-40通過競(jìng)爭(zhēng)性與NgR結(jié)合，促進(jìn)神經(jīng)軸突生長通過損傷區(qū)，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷的修復(fù)中發(fā)揮著關(guān)鍵的作用[16]。

隨著藥物、基因、細(xì)胞、高壓氧[17]等治療技術(shù)的發(fā)展，神經(jīng)損傷后修復(fù)明顯進(jìn)步。已發(fā)展為綜合的多技術(shù)、多學(xué)科療法[18，19]。雖在一定程度上可緩解癥狀，但無法根本上恢復(fù)脊髓功能[20]。Teng等[21]觀察到NEP1-40促進(jìn)脊髓損傷后軸突再生效果確切，是目前研究脊髓損傷后促進(jìn)神經(jīng)再生的熱點(diǎn)，相信在不久的將來，有一定的臨床應(yīng)用前景。

[參考文獻(xiàn)]

[1] Martin Ginis KA，J rgensen S，Stapleton J. Exercise and sport for persons with spinal cord injury[J]. PMR，2012，4（11）：894-900.

[2] Yu P，Huang L，Zou J，et al. Immunization with recombinant Nogo-66 receptor（NgR） promote saxonal regeneration and recovery of function after spinal cordinjury in rats[J].Neurobiol Dis，2008，32（3）：535-542.

[3] Li S，Strittmatter SM. Delayed systemic Nogo-66 receptor antago-nistpromotes recovery from spinal cordinjury[J].Neurosci，2003，23（10）：4219-4227.

[4] 熊春翔，宗少暉，曾高峰，等. 大鼠Alles脊髓損傷模型化建立及評(píng)價(jià)[J]. 廣州醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，28（2）：215-217.

[5] Li Shenghua，Guo Pingde，Wang Wenjing. Current situation and progression in the treatment of spinal cord injury[J].China J Orthop & Trauma，2010，23（1）：70-73.

[6] Savaskan NE，Weinmann O，Heimrich B，et al. High resolution neurochemical gold staining method for myelin in peripheral and central nervous system at the light-and electron-microscopic level[J]. Cell and Tissue Research，2009，337（2）：213-221.

[7] Woolf CJ，Bloechlinger S. It takes more than two to Nogo[J].Science，2002，297（5584）：1132-1134.

[8] Yamashita T，F(xiàn)ujitani M，Yamagishi S，et al. Multiple signals regulate axon regen-eration through the nogo receptor complex[J]. Mol Neurobiol，2005，32（2）：105-111.

[9] Steward O，Sharp K，Yee KM，et al. A reassessment of the effects of a Nogo-66 receptor antagonist on regenerative growth of axons and locomotor recovery after spinal cord injury in mice[J]. Exp Neurol，2008，209（2）：446-468.

[10] Walmsley AR，Mir AK. Targeting the Nogo-A signalling pathway topromote recovery following acute CNS injury[J].rr Pharm Des，2007，13（24）：2470-2484.

[11] Yu P，Huang Zou. Immunization with recombinant Nogo-66 receptor （NgR） promotes axonal regeneration and recovery of function after spinal cord injury in rats[J]. Neurobiol Dis，2008，32（3）：535-542.

[13] GrandPre T. Nogo-66 receptor antagonist peptidepromotes axonal regeneration[J]. Nature，2002，417：547-551.

[14] Koda M，Hashimoto M，Mu rakami M，et al. Adenovirus vector-mediated in vivo genetransfer of brain-derived neurot rophic factor（BDNF） promot es rub rospinal axonal regeneration and functional recovery after complete trans ection of the adult rat spinalcord[J]. Neurotrauma，2004， 21（3）：329-337.

[15] Cao L，Liu L，Chen ZY，et al. Olfactory ensheathing cells genetically modified to secret GDNF to promote spinal cord repair[J]. Brain，2004，127（pt3）：535-549.

[16] Harvey PA，Lee DH，Qian F. Blockade of Nogo receptor ligands promotes functional regeneration of sensory axons after dorsal root crush[J]. The Journal of Neuroscience，2009，29（19）：6285-6295.

[17] 孫文志，魯世保. 高壓氧治療脊髓損傷機(jī)制的研究進(jìn)展[J]. 中國脊柱脊髓雜志，2014，24（12）：1116-1119.

[18] Tos P，Ronchi G，Geuna S，et al. Future perspectives in nerve repair and regeneration[J]. Int Rev Neurobiol，2013， 109：165-192.

[20] 石良晨，秦峰. 膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子修飾骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植與傳統(tǒng)方法治療脊髓損傷研究進(jìn)展[J].中華實(shí)用診斷與治療雜志，2015，29（5）：423-425.

[21] Lee JK，Kim JE，Sivula M，et al. Nogo receptor antagonism promotes strok covery by enhancing axonal plasticity[J]. J Neurosci，2004，24（27）：6209-6217.

（收稿日期：2015-08-23）