摘 要：乙酰膽堿酯酶（AChE）是一種廣泛存在于脊椎動(dòng)物和無(wú)脊椎動(dòng)物體內(nèi)，在神經(jīng)傳導(dǎo)中起著重要的作用的水解酶。研究發(fā)現(xiàn)，暴露于亞致死濃度的殺蟲劑AChE會(huì)被嚴(yán)重抑制，因此這種酶常用來(lái)作為評(píng)價(jià)環(huán)境污染的生物標(biāo)志物；Na+-K+-ATPase則幾乎存在于所有動(dòng)物的細(xì)胞膜上，是橫跨質(zhì)膜的一種重要酶類，其維護(hù)的離子梯度具有重要的生理意義。水體中污染物如農(nóng)藥、工業(yè)品多氯聯(lián)笨等物質(zhì)對(duì)許多水生無(wú)脊椎動(dòng)物Na+-K+-ATPase有著不同程度的抑制作用。為此，本試驗(yàn)研究了克氏原螯蝦暴露于亞致死濃度氯氰菊酯和吡蟲啉后AChE和Na+-K+-ATPase的活性變化，為選用生物標(biāo)志物或早期預(yù)警系統(tǒng)監(jiān)測(cè)環(huán)境中的有關(guān)農(nóng)藥以及評(píng)估這兩種農(nóng)藥對(duì)養(yǎng)殖優(yōu)勢(shì)種克氏原螯蝦的危害性提供依據(jù)。

關(guān)鍵詞：氯氰菊酯；吡蟲啉；克氏原螯蝦

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)用蝦

實(shí)驗(yàn)用蝦采于鄱陽(yáng)湖南磯山水域，體長(zhǎng)8±0.474cm，體重13±2.669g，試驗(yàn)前在水箱中暫養(yǎng)7-10天，所用水為充分曝氣的自來(lái)水，試驗(yàn)時(shí)選擇無(wú)病傷，個(gè)體健壯，活力強(qiáng)的蝦。

1.2 試劑及儀器

722分光光度計(jì)，電子分析天平，玻璃勻漿器，恒溫水浴鍋，TGL-16A臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，烘箱，冰箱等。試劑盒均采購(gòu)于南京建成生物研究所，具體操作按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

1.3 馴養(yǎng)

實(shí)驗(yàn)用蝦在實(shí)驗(yàn)前馴養(yǎng)于塑料水族箱中，試驗(yàn)用水為去氯自來(lái)水，不間斷充氣，水溫13.77±1.77℃，pH值6.71±0.17，溶解氧（DO）為7.13±0.51，每日換水并投放飼料。一周后開始正式實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)前24h停止喂食，試驗(yàn)期間不再喂食。

1.4 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

按實(shí)驗(yàn)得到的克氏原螯蝦氯氰菊酯96hLC50（0.06mg/L）將脅迫濃度設(shè)為0-0.060mg/L范圍內(nèi)的6個(gè)濃度，分別是0，0.012，0.024，0.036，0.048和0.060mg/L。同樣地根據(jù)吡蟲啉96hLC50（10.98mg/L）將吡蟲啉溶液設(shè)為6個(gè)濃度，分別為0，2.2，4.4，6.6，8.8和10.98mg/L。每個(gè)水族箱隨機(jī)挑選10只健康活潑的克氏原螯蝦，脅迫實(shí)驗(yàn)持續(xù)進(jìn)行24h，實(shí)驗(yàn)期間不間斷充氣。

1.5 樣品制備

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，從實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組分別隨機(jī)取出5尾克氏原螯蝦，沖洗后擦干、稱重、在冰塊上快速解剖取出適量鰓組織，剔除附著物，用濾紙吸干表面水分，電子天平稱重后，將所取樣品按其重量分別加入10倍 （w：v）的預(yù)冷重蒸水，在-4℃下用研磨成勻漿，取勻漿液用高速冷凍離心機(jī)離心（0-4℃，l0000r/min，30min），取上清液作為待測(cè)樣液進(jìn)行酶活性測(cè)定，置于4℃冰箱中備用，放置時(shí)間不超過(guò)24h。

1.6 酶活測(cè)定

AChE活性試劑盒采用巰基顯色法，其定義為：每毫克組織蛋白在37℃保溫6分鐘，水解反應(yīng)體系中1umol基質(zhì)為1個(gè)活力單位（U/mgprot）。

蛋白含量采用Bradford法測(cè)定，以牛血清蛋白（BSA）為標(biāo)準(zhǔn)蛋白，單位：g/L。

2 結(jié)果與討論

2.1 氯氰菊酯對(duì)克氏原螯蝦鰓AChE和Na+-K+-ATPase活性的影響

2.1.1氯氰菊酯對(duì)克氏原螯蝦鰓AChE活性的影響

氯氰菊酯脅迫下，克氏原螯蝦乙酰膽堿酯酶活力變化情況見圖1。從圖中可以看出，受試蝦乙酰膽堿酯酶活力變化隨著氯氰菊酯濃度的升高，其活力呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。在0.012mg/L組其活力達(dá)到最大，呈現(xiàn)出誘導(dǎo)作用，酶活性較對(duì)照組上升了93.8%；0.06mg/L組活性最低，顯示出一定的抑制作用，酶活性降至空白對(duì)照組的69.0%， 0.012mg/L處理組和對(duì)照組、0.048mg/L、0.060mg/L組間具有顯著性差異（P<0.05）。但除此外，其它處理組和空白對(duì)照組之間活性均不具有顯著性差異（P>0.05）。

2.1.2氯氰菊酯對(duì)克氏原螯蝦鰓Na+-K+-ATPase活性的影響

從上圖可以看出克氏原螯蝦在亞致死濃度氯氰菊酯脅迫下，其Na+-K+-ATPase的活性變化。隨著暴露濃度的增加， Na+-K+-ATPase活性逐漸下降， 在最高濃度0.06mg/L組，其活性降至最低，僅為空白對(duì)照組的27.7%，其它各組的活性分別為空白對(duì)照組的64.6%，48.9% 、31.2% 、29.5%，但各處理組及對(duì)照組間的活性均無(wú)顯著性差異（P>0.05）

2.1.3討論

大量的研究結(jié)果表明，環(huán)境中的許多有毒物質(zhì)（農(nóng)藥、重金屬離子、燃油及工業(yè)廢水等），均可能抑制乙酰膽堿酯酶（AChE）和Na+-K+-ATPase。劉曉宇等報(bào)道了敵敵畏、辛硫磷和樂果對(duì)鱘魚腦乙酰膽堿酯酶活性的抑制作用；Galgani等在研究北海大范圍水域中比目魚組織中乙酰膽堿酯酶活性中發(fā)現(xiàn)，隨著水域中污染的梯度變化，乙酰膽堿酯酶活性也隨之發(fā)生變化；謝卓丘報(bào)道溴氰菊酯對(duì)大鼠腦AChE的活性無(wú)抑制作用，同時(shí)周志剛等也認(rèn)為溴氰菊酯對(duì)草魚無(wú)顯著影響，但Bendahou N報(bào)道溴氰菊酯對(duì)蜜蜂AChE活性卻具有顯著降低的作用，商利新在實(shí)驗(yàn)中也得出結(jié)論，氯氰菊酯對(duì)日本沼蝦乙酰膽堿酯酶（AChE）和Na+-K+-ATPase有明顯的抑制作用?？梢婋S著不同物種體內(nèi)的代謝速度、解毒酶活力以及乙酰膽堿酯酶敏感程度不同，它們的耐毒能力大不相同，相同毒物對(duì)于不同生物表現(xiàn)出不同的毒性作用。本實(shí)驗(yàn)中結(jié)果表明，亞致死濃度的氯氰菊酯脅迫下，受試蝦乙酰膽堿酯酶活力不僅沒有被抑制，反而被誘導(dǎo)，活力相對(duì)增強(qiáng)，在氯氰菊酯濃度達(dá)到0.036mg/L脅迫時(shí)，乙酰膽堿酯酶活力出現(xiàn)下降，但與對(duì)照組無(wú)顯著差異，可見于亞致死濃度氯氰菊酯對(duì)克氏原螯蝦乙酰膽堿酯酶的毒害作用不是很明顯，但對(duì)Na+-K+-ATPase活性的影響的比較顯著，隨著脅迫濃度的升高，其活性不斷地下降，表現(xiàn)出一定的劑量-效應(yīng)關(guān)系。說(shuō)明氯氰菊酯損害了其細(xì)胞膜功能，影響受試蝦的水鹽代謝的調(diào)節(jié)，這與其它報(bào)道的結(jié)果基本上是一致的。由此可見，低濃度的氯氰菊酯對(duì)其神經(jīng)毒害的作用不明顯，不會(huì)抑制受試蝦的乙酰膽堿酯酶活性，但對(duì)細(xì)胞膜有較明顯的毒性作用，一旦脅迫濃度再升高，必將會(huì)導(dǎo)致螯蝦大量死亡。

2.2 吡蟲啉對(duì)克氏原螯蝦鰓AchE和Na+-K+-ATPase活性的影響

2.2.1吡蟲啉對(duì)克氏原螯蝦鰓AchE活性的影響

圖3說(shuō)明了克氏原螯蝦隨著吡蟲啉脅迫濃度的增大，其乙酰膽堿酯酶活力的變化情況。從圖中可以得知，受試蝦乙酰膽堿酯酶活力變化與在氯氰菊酯脅迫下所表現(xiàn)出的變化非常相似，也是先上升后下降的趨勢(shì)。在2.2mg/L組其活力達(dá)到最大，酶活性高出空白對(duì)照組59.8%，其誘導(dǎo)作用達(dá)到顯著水平（P<0.05），4.4mg/L處理組活性僅低于2.2mg/L處理組，活性高出對(duì)照組54.1%，誘導(dǎo)作用也表現(xiàn)出顯著性差異（P<0.05）；11mg/L組活性最低，顯示出一定的抑制作用，酶活性僅為對(duì)照組的52.7%，并且11mg/L組和2.2mg/L組間具有顯著性差異（P<0.05）。但各處理組活性與對(duì)照組之間不具有顯著性差別（P>0.05）。

2.2.2吡蟲啉對(duì)克氏原螯蝦鰓Na+-K+-ATPase活性的影響

亞致死濃度吡蟲啉脅迫對(duì)受試克氏原螯蝦 Na+-K+-ATPase活性的影響見上圖。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，隨著脅迫濃度的增加，其活性總體呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢(shì)，這與氯氰菊酯脅迫后，其Na+-K+-ATPase活性變化有著較大的差別，并且處理組間活性差異顯著（P<0.05），2.2和6.6mg/L兩處理組活性與空白對(duì)照組活性存在顯著性差異（P<0.05），8.8mg/L處理組與其它各組間也均表現(xiàn)出顯著性差異（P<0.05）。

2.2.3討論

從之前的一些學(xué)者的研究結(jié)果知道，絕大多數(shù)的有機(jī)農(nóng)藥會(huì)抑制水生生物乙酰膽堿酯酶的活性，但在本實(shí)驗(yàn)中，低濃度的吡蟲啉對(duì)受試蝦乙酰膽堿酯酶沒有表現(xiàn)出明顯的抑制作用，僅當(dāng)濃度增加到11mg/L時(shí)，其活性才開始被有所抑制，這與氯氰菊酯對(duì)克氏原螯蝦乙酰膽堿酯酶的影響結(jié)果一致。但對(duì)Na+-K+-ATPase酶活性的影響則沒有表現(xiàn)出很明顯的規(guī)律性，大致為低濃度時(shí)抑制，濃度增加時(shí)反而被誘導(dǎo)，活性較對(duì)照組高，這與氯氰菊酯對(duì)該蝦Na+-K+-ATPase的影響結(jié)果有很大的不同，前者是活性隨脅迫濃度的升高，其活性逐漸下降，而后者則為先下降后上升。因此本文認(rèn)為受試克氏原螯蝦乙酰膽堿酯酶和Na+-K+-ATPase酶對(duì)吡蟲啉這種農(nóng)藥的敏感性不高，這可能與不同生物對(duì)不同農(nóng)藥的解毒酶所起的作用不同有關(guān)。至于如何對(duì)乙酰膽堿酯酶和Na+-K+-ATPase酶產(chǎn)生抑制和誘導(dǎo)效應(yīng)，是直接抑制或誘導(dǎo)酶活性還是中毒后引起異常生理變化，還是間接引起酶活性降低，尚有待進(jìn)一步研究。

3 小結(jié)

在系列亞致死濃度的氯氰菊酯和吡蟲啉農(nóng)藥脅迫下，克氏原螯蝦鰓的乙酰膽堿酯酶和Na+-K+-ATPase酶表現(xiàn)出不同的敏感性。乙酰膽堿酯酶（AChE）在兩種農(nóng)藥脅迫下均表現(xiàn)為一定的誘導(dǎo)作用，Na+-K+-ATPase酶在氯氰菊酯脅迫下表現(xiàn)為較明顯的抑制作用，但在吡蟲啉脅迫下，活性變化規(guī)律不是很明顯，總體為先下降后上升。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，氯氰菊酯和吡蟲啉對(duì)克氏原螯蝦神經(jīng)毒害的作用不明顯，氯氰菊酯對(duì)其膜功能有較大的影響，吡蟲啉對(duì)膜功能則不具有較強(qiáng)的毒性作用。

參考文獻(xiàn)：

[1]黃婷.氯氰菊酯和吡蟲啉對(duì)克氏原螯蝦耗氧率和排氨率的影響[J].科技經(jīng)濟(jì)市場(chǎng)，2011（5）.