黃暢+高建軍

摘要：克氏原螯蝦（Procambarus clarkii ）俗稱口味蝦，是我國(guó)南方的著名食用蝦，也是目前全世界養(yǎng)殖范圍最廣的淡水螯蝦。我們選擇活體克氏原螯蝦腸道組織為材料，經(jīng)過超聲破碎、高效液相色譜分離、質(zhì)譜和光譜分析、抗菌活性檢測(cè)。發(fā)現(xiàn)螯蝦腸道含有一種相對(duì)分子質(zhì)量為245.17的新型化合物PC245，其最大吸收波長(zhǎng)237nm，同時(shí)對(duì)嗜水氣單孢菌、大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均具有明顯的抑菌作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：該抗菌活性物質(zhì)是一種廣譜、高效的新型抗菌天然產(chǎn)物，

具有潛在的開發(fā)利用價(jià)值。

關(guān)鍵詞：克氏原螯蝦；消化道；抑菌活性；分離；鑒定

人類為了預(yù)防、治療微生物引起的疾病傳播，發(fā)明了多種有效抗菌物質(zhì)，并將它們添加到食品、日用品和保健品中，其中使用最廣泛的就是抗生素。然而由于抗生素類藥物的大量長(zhǎng)期使用，導(dǎo)致了耐藥細(xì)菌甚至超級(jí)細(xì)菌的出現(xiàn)，給動(dòng)植物細(xì)菌病的防治帶來了嚴(yán)重的挑戰(zhàn)[1]。因此開發(fā)新的抗菌藥物，突破抗生素耐藥性難題，已經(jīng)成為當(dāng)今世界關(guān)注的焦點(diǎn)和研究的熱點(diǎn)。

從動(dòng)植物和微生物中提取天然抗菌活性物質(zhì)是尋找新型抗菌藥物的重要途徑，因?yàn)樘烊豢咕钚晕镔|(zhì)具有高效、低毒、無(wú)污染和來源廣等特點(diǎn)，可以有效抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)，同時(shí)也不會(huì)對(duì)環(huán)境造成污染，產(chǎn)生抗藥性[2]。

克氏原螯蝦屬甲殼綱，十足目，蝲蛄科，螯蝦亞科，原螯蝦屬，體黑紅色；原產(chǎn)于美國(guó)、墨西哥以及古巴的淡水中[3]。日本在1918年作為牛蛙餌料從美國(guó)引入，1929年從日本引入我國(guó)南京地區(qū)，現(xiàn)主要分布于長(zhǎng)江中下游各水域，并成為我國(guó)淡水蝦類養(yǎng)殖的一種重要資源；同時(shí)又是生態(tài)競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)而導(dǎo)致破壞性危害的外來物種[4]。螯蝦可以在滿布細(xì)菌、比較骯臟、受污染的水體中生活，同時(shí)靠水中腐敗的植物和動(dòng)物尸體為食的獨(dú)特食性，這為研究抗菌肽的多樣性和適應(yīng)性提供了理想的材料，本文以克氏原螯蝦為材料，從消化道分泌物中分離新型抗菌活性化合物，并對(duì)其結(jié)構(gòu)和抑菌活性進(jìn)行研究。

1 材料

1.1 材料?？耸显r從湖南岳陽(yáng)鄉(xiāng)下購(gòu)得。嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）、大腸桿菌（Escherichia coli）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）由中南林業(yè)科技大學(xué)提供。

1.2 試劑與儀器。三氟乙酸（TFA），Sigma 公司生產(chǎn)；乙腈，Merck公司生產(chǎn)；HCCA（-氰基- 4-羥基肉桂酸） ，美國(guó)ICN 生物醫(yī)學(xué)公司生產(chǎn)；高效液相色譜儀（Alliance 2695與1525），美國(guó)Waters公司；C- 18色譜柱（250mm×20.00mm和250mm×4.60mm），美國(guó)菲羅門公司；質(zhì)譜儀（MALDI- TOF/ TOF），德國(guó)Bruker公司；高速冷凍離心機(jī)（5804R），美國(guó)Eppendorf公司；高壓滅菌鍋（HVE- 50）美國(guó)HIRAYAMA公司。

1.3 培養(yǎng)基。LB液體培養(yǎng)基： 稱取LB固體培養(yǎng)基1.8 g溶于100 mL蒸餾水中，煮沸至完全溶解，分裝于試管，121℃高壓滅菌20 min，備用。

MH固體培養(yǎng)基（MH瓊脂平板） ： 稱取Mueller- Hinton瓊脂（MHA） 3.8 g溶于100 mL蒸餾水中，煮沸至完全溶解，121℃高壓滅菌20 min，冷卻至55℃傾注平板，備用。

2 方法

2.1 螯蝦腸道抗菌活性物質(zhì)提取。選擇新鮮的克氏原螯蝦，在蝦頭部剪一個(gè)口子，然后從該開口處沿蝦背部剪開至蝦尾，得到蝦腸，清除脂肪、腸道內(nèi)容物后剪碎。先用組織搗碎機(jī)搗碎，再用超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)破碎10次，每次3s。加入超純水4℃攪拌過夜。次日將混合物于4℃、8000r/min離心30min，取上清液冷凍干燥即為抗菌活性物質(zhì)粗提物。

2.2 反相高效液相色譜純化。第一次反相色譜純化在配備1525泵和2487雙波長(zhǎng)檢測(cè)器的高效液相色譜系統(tǒng)上進(jìn)行；收集各洗脫峰，并經(jīng)冷凍干燥后，保存?zhèn)溆?。目的組分第二次反相色譜純化在配備2489雙波長(zhǎng)檢測(cè)器的Alliance 2695系統(tǒng)上進(jìn)行；流動(dòng)相采用二元梯度：A液含0.1%三氟乙酸水溶液，B液含0.1%三氟乙酸的乙腈；檢測(cè)波長(zhǎng)為280nm與215nm雙波長(zhǎng)；柱溫箱為35℃；分析型C- 18色譜柱為（250mm×4.60mm美國(guó)菲羅門公司的Lunar柱）。洗脫梯度見表1。

2.3 質(zhì)譜分析。質(zhì)譜分析在Bruker公司Micro- TOF QII上進(jìn)行。對(duì)篩選得到的目標(biāo)樣品用50%蒸餾水與50%的乙腈溶解后，加入0.1%的甲酸混勻，進(jìn)樣；霧化氣為氮?dú)?，正離子模式下測(cè)定目標(biāo)組分的相對(duì)分子質(zhì)量。

2.4光譜分析。在日立UV2300紫外/可見分光光度儀上進(jìn)行。波長(zhǎng)范圍：200～1100nm；掃描速度：100nm/min；自動(dòng)切換波長(zhǎng)為340nm。將篩選得到的樣品體積100L進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，測(cè)定目標(biāo)組分的吸收波長(zhǎng)。

2.5 抑菌活性分析。采用紙片擴(kuò)散法測(cè)定抑菌效果。將試驗(yàn)菌復(fù)蘇，按0.1%的接種量搖菌培養(yǎng)14- 16h；然后按每平板100- 200 L均勻涂布于營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板（ 9 cm），待稍干后貼上無(wú)菌濾紙片（6 mm），在各個(gè)濾紙片上分別滴加10、20、30、40L各洗脫峰凍干樣品（40 mg/ml）；同時(shí)設(shè)置滴加無(wú)菌生理鹽水（20 L）為空白對(duì)照；4℃靜置3h，37℃恒溫培養(yǎng)24 h，測(cè)定抑菌圈的大小，以判斷目標(biāo)樣品的抑菌效果。

3 結(jié)果與分析

3.1螯蝦腸道組織樣品制備。螯蝦腸道組織經(jīng)超聲波破碎提取后，離心并取上清冷凍干燥，粗提樣品為淡黃色粘稠狀的固態(tài)物質(zhì)。粗提樣品的檢測(cè)、純化、活性分析，每次用50ml蒸餾水溶解，0.22μm針式過濾頭過濾后待用。

3.2反相高效液相色譜純化。螯蝦腸道組織粗提樣品經(jīng)HPLC分離，在280nm和215nm雙波長(zhǎng)檢測(cè)條件下，螯蝦腸道組織粗提樣品得到10個(gè)比較大的吸收峰，其中保留時(shí)間最短為4.75分鐘，最長(zhǎng)為30.42分鐘。抑菌試驗(yàn)篩查實(shí)驗(yàn)顯示色譜純化中保留時(shí)間為4.75分鐘的洗脫峰對(duì)嗜水氣單孢菌、大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均具明顯的抑菌效果。因此，選擇該洗脫峰作為目標(biāo)組分進(jìn)行二次純化（見圖1）。

從圖1可看到帶星號(hào)的洗脫主峰是目標(biāo)峰，旁邊還有幾個(gè)小峰，洗脫溶液無(wú)色透明，說明目標(biāo)組分通過二次純化后變得更純了。

3.3 質(zhì)譜分析。目標(biāo)組分經(jīng)質(zhì)譜分析結(jié)果見圖2。從圖可知：目標(biāo)組分主峰的相對(duì)分子質(zhì)量為246.17（M+H+），據(jù)此，將該樣品組分命名為PC245；同時(shí)，質(zhì)譜分析圖上沒有出現(xiàn)其它較大的分子離子峰，說明二次反相純化后，目標(biāo)組分樣品非常純。

3.4光譜分析。目標(biāo)組分經(jīng)UV2300紫外/可見分光光度儀分析結(jié)果見圖3。從圖3可知：目標(biāo)組分在237 nm波長(zhǎng)處有最大吸收峰，峰值為0.419。

3.5抑菌活性測(cè)定。將目標(biāo)組分PC245對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、嗜水氣單胞菌的抑菌實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，見圖4、圖5、圖6的抑菌效果。

圖4 PC245對(duì)大腸桿菌的抑制作用

圖4沿順時(shí)針方向滴加樣品體積數(shù)分別為10、20、30、40 μL，平板中間的濾紙片滴加無(wú)菌生理鹽水作對(duì)照。

圖5沿順時(shí)針方向滴加樣品體積數(shù)分別為10、20、30、40μL，平板中間的濾紙片滴加無(wú)菌生理鹽水作對(duì)照。

圖6沿逆時(shí)針方向滴加樣品體積數(shù)分別為10、20、30、40 μL。平板中間的濾紙片滴加無(wú)菌生理鹽水作對(duì)照。

從圖4、5、6可看到：在濾紙片的周圍出現(xiàn)透明抑菌圈，且抑菌圈的大小隨樣品體積的增加而增大，說明有量、效關(guān)系；同時(shí)也可看到PC245對(duì)嗜水氣單胞菌的抑菌圈比大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的更大、更清晰、更透明，說明PC245對(duì)嗜水氣單胞菌的抑菌效果更好。

4 討論

提取天然抗菌活性物質(zhì)來防治細(xì)菌病已經(jīng)成為動(dòng)植物抗菌制劑開發(fā)的新趨勢(shì)。從克氏原螯蝦消化道提取抗菌活性物質(zhì)是找尋抗菌活性化合物的一種新思路[5]。

大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和嗜水氣單孢菌是三種常見的致病菌，其中嗜水氣單胞菌廣泛存在于水體環(huán)境中，是造成淡水蝦、魚類出現(xiàn)敗血癥的病原菌[6]。

本項(xiàng)目將從活體克氏原螯蝦獲得的腸道組織進(jìn)行超聲破碎提取，經(jīng)高效液相色譜分離純化，得到一種新型化合物PC245；紫外/可見分光光度掃描顯示PC245在237nm波長(zhǎng)處的紫外區(qū)具最大吸收波長(zhǎng)，分子量比較小，親水性強(qiáng)，推測(cè)是一種小分子有機(jī)化合物；抑菌實(shí)驗(yàn)證明PC245對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和嗜水氣單孢菌均具有抑制效果，而且在相同濃度下，PC245對(duì)嗜水氣單孢菌抑制作用更明顯，但是PC245的化學(xué)結(jié)構(gòu)還需進(jìn)一步確認(rèn)，其完整生物學(xué)活性也有待更深入的研究。

參考文獻(xiàn)

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