李江姣 杜慧竟 石繼春 徐 苗 葉 強(qiáng)

中國食品藥品檢定研究院衛(wèi)生部生物技術(shù)產(chǎn)品檢定方法及其標(biāo)準(zhǔn)化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100050

肺炎鏈球菌可以引起肺炎、菌血癥、腦膜炎、中耳炎等疾病，是兒童和老年人獲得性感染的主要病原菌[1]；接種肺炎鏈球菌疫苗可以有效預(yù)防肺炎鏈球菌感染[2]。為了保證疫苗質(zhì)量，所有肺炎鏈球菌疫苗上市前均需對其免疫保護(hù)效力進(jìn)行測定。目前針對該疫苗，普遍采用的體外效力檢測方法是酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA），利用抗原-抗體的特異性結(jié)合特性對待測血清中的抗體水平進(jìn)行檢測[3]；但該類方法只能檢測抗體的總含量，無法將功能性抗體甄別出來，不能真實(shí)反映疫苗的免疫保護(hù)效果。事實(shí)上，對于一些特殊人群，如老年人和免疫系統(tǒng)不完善的人群，接種疫苗后產(chǎn)生的抗體往往是非功能性抗體，不能發(fā)揮免疫保護(hù)作用[4-5]?？梢姡绻麊渭円钥贵w含量來評估疫苗質(zhì)量，很可能無法準(zhǔn)確鑒定疫苗的保護(hù)效力。因此，迫切需要建立能夠準(zhǔn)確反映功能性抗體含量的檢定方法，以便能夠正確評估肺炎鏈球菌疫苗的保護(hù)效力和質(zhì)量。

肺炎球菌疫苗的保護(hù)機(jī)制主要是通過特異性抗體介導(dǎo)的調(diào)理吞噬作用將體內(nèi)的肺炎球菌清除。所謂調(diào)理吞噬作用是指抗體、補(bǔ)體與吞噬細(xì)胞表面結(jié)合，促進(jìn)吞噬細(xì)胞吞噬細(xì)菌等顆粒性抗原的作用。由此可見，注射疫苗后只有機(jī)體產(chǎn)生能夠有效介導(dǎo)調(diào)理吞噬作用的功能性抗體，才能發(fā)揮真正的免疫保護(hù)作用。通過體外調(diào)理吞噬實(shí)驗(yàn) （opsonophagocytic assay，OPA）檢測抗體的調(diào)理吞噬活性，能夠直接反映功能性抗體含量，實(shí)現(xiàn)對疫苗保護(hù)效力的準(zhǔn)確評估[6]。已有多項(xiàng)研究表明，OPA與疫苗臨床有效性的相關(guān)性要高于ELISA[7-8]。

近年來，國際上多個(gè)實(shí)驗(yàn)室開始致力于OPA技術(shù)的研發(fā)，試圖建立一套穩(wěn)定、可靠、標(biāo)準(zhǔn)化的檢測方法。美國阿拉巴馬大學(xué)通過長期探索，建立了優(yōu)化的多重調(diào)理吞噬實(shí)驗(yàn)（multiplexed opsonophagocytic killing assay，MOPA），可同時(shí)對4種血清型的肺炎球菌功能抗體進(jìn)行檢測，簡化了實(shí)驗(yàn)流程，減少了工作量并節(jié)約血清樣本，提高了OPA技術(shù)的檢測通量[9]。并且國外部分藥企已經(jīng)開始采用OPA方法進(jìn)行肺炎鏈球菌疫苗的臨床效力評價(jià)[8，10-11]。但由于該方法操作較為復(fù)雜，技術(shù)要求高，目前國內(nèi)該方法的研究和應(yīng)用比較缺乏。本研究參考美國阿拉巴馬大學(xué)大學(xué)的MOPA實(shí)驗(yàn)，結(jié)合國內(nèi)的實(shí)際情況，旨在建立一套適合我國應(yīng)用的肺炎鏈球菌疫苗效力評價(jià)方法。

1 材料與方法

1.1 材料

HL-60 細(xì)胞系購自美國 ATCC（CCL-240）；13 個(gè)血清型的肺炎鏈球菌菌株（帶有特定抗生素抗性）來源于美國阿拉巴馬大學(xué)伯明翰分校Moon H Nahm實(shí)驗(yàn)室；5份血清樣本來源于23價(jià)肺炎球菌多糖疫苗免疫后的健康人群；SPF級新西蘭乳兔（3～4周齡）由中國食品藥品檢定研究院衛(wèi)生部生物技術(shù)產(chǎn)品檢定方法及其標(biāo)準(zhǔn)化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 試劑

BactoTMTodd Hewitt Broth （THB）（批號：3071477）、酵母提取物（批號：2220095）購自BectonDickinson公司；RPMI1640（批號：1393807）、胎牛血清（批號：1428479）購自 Gibco公司； 二甲基甲酰胺 （DMF）（批號：3345C432）、2，3，5-氯化三苯基四氮唑 （TTC）（批號：2532B313）購自 Amresco公司；Anti-CD11b PE（批號：2184659）、Anti-CD35PE（批號：2326940）、Anti-CD71 PE（批號：2292633）、Annexin V FITC（批號：2202518）、Propodium Iodide（PI）（批號：SLBB4626V）和 Annexin V Binging Buffer（批號：30435）購自 BD Pharmingen 公司；4 種抗生素：奧普脫欣（Optochin，批號：051M1257V）、奇霉素（Spectinomycin，批號：102K05447V）、甲氧芐氨嘧啶（Trimethoprim，批號：BCBC9232V）、鏈霉素（Streptomycin，批號：2036B318）購于 Sigma 公司。

1.3 儀器

菌落計(jì)數(shù)器（型號：ProtoCOL 3）購自英國Synbiosis公司；流式細(xì)胞儀（型號：FACS Calibur）購自美國BD公司。

1.4 HL-60細(xì)胞的培養(yǎng)及主代細(xì)胞庫的建立

從ATCC購買的原始HL-60細(xì)胞經(jīng)復(fù)蘇、增殖培養(yǎng)、再凍存建立一個(gè)主代細(xì)胞庫（80管）。

1.5 HL-60細(xì)胞的分化及鑒定

使用DMF誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞分化5 d，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。具體分化步驟及鑒定方法參考文獻(xiàn)[12]。

1.6 肺炎鏈球菌工作種子批的制備及鑒定

1.6.1 肺炎鏈球菌工作種子批的制備 來源于美國阿拉巴馬大學(xué)的各型肺炎鏈球菌，37℃培養(yǎng)過夜后轉(zhuǎn)移至THY液體培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)至OD600為0.6～0.9，收集培養(yǎng)液加80%甘油混勻后分裝凍存，制備工作種子批。

1.6.2 凍存菌種活力檢測 將凍存菌種與未經(jīng)冷凍的細(xì)菌同步稀釋后，37℃過夜培養(yǎng)后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，計(jì)算冷凍細(xì)菌的復(fù)活率。

1.6.3 凍存細(xì)菌抗生素抗性及敏感性檢測 在分別含4種抗生素（奧普脫欣、奇霉素、鏈霉素、甲氧芐氨嘧啶）的培養(yǎng)基和不加抗生素的對照培養(yǎng)基中，劃線接種13個(gè)型的肺炎鏈球菌，37℃培養(yǎng)過夜后進(jìn)行觀察。

1.6.4 凍存細(xì)菌工作稀釋度的確定 按照參考文獻(xiàn)[12]的方法進(jìn)行工作稀釋度的測定。選擇菌落數(shù)為80～120 cfu/spot的稀釋度作為最佳稀釋度。

1.7 補(bǔ)體制備及鑒定

取SPF級新西蘭乳兔頸動(dòng)脈采血獲得補(bǔ)體，按照文獻(xiàn)[12]的方法測定該批次補(bǔ)體的非特異性殺菌率。

1.8 調(diào)理吞噬試驗(yàn)

將待測血清在56℃水浴中滅活30 min，按照參考文獻(xiàn)[12]的方法進(jìn)行操作。經(jīng)菌落計(jì)數(shù)后，用軟件Opsotiter3計(jì)算樣本的調(diào)理吞噬滴度。

2 結(jié)果

2.1 HL-60細(xì)胞的表面標(biāo)志鑒定和活力測定

經(jīng)測定，未分化的HL-60細(xì)胞表面標(biāo)志表達(dá)量：CD35為 7.03%，CD71為 88.87%，活細(xì)胞比例為88.89%（圖1）。HL-60細(xì)胞在誘導(dǎo)分化5 d后表面標(biāo)志表達(dá)量：CD35為71.78%，CD71為10.97%，活細(xì)胞比例為72.96%（圖2）。阿拉巴馬大學(xué)參考方法的標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，分化后活性細(xì)胞比例應(yīng)≥65%，CD35表達(dá)應(yīng)≥55%，CD71表達(dá)應(yīng)≤20%。本實(shí)驗(yàn)測得的各項(xiàng)指標(biāo)均符合阿拉巴馬大學(xué)參考方法的各項(xiàng)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，可用作OPA實(shí)驗(yàn)的效應(yīng)細(xì)胞。

圖1 未分化HL-60細(xì)胞表面標(biāo)志表達(dá)量及細(xì)胞活力檢測

圖2 HL-60細(xì)胞分化后表面標(biāo)志表達(dá)量及細(xì)胞活力檢測

2.2 肺炎鏈球菌工作菌種的鑒定

2.2.1 凍存工作種子的復(fù)活率 結(jié)果顯示，13個(gè)血清型的凍存肺炎鏈球菌工作菌種的復(fù)活率分別為：1型94%，3型 92%，4型 96%，5型 95%，6A 型 94%，6B型 93%，7F型 91%，9V 型 93%，14型 94%，18C型94%，19A型95%，19F型96%，23F型95%，均高于90%。

2.2.2 工作菌種的抗生素抗性與敏感性檢測 結(jié)果顯示，各型工作菌種均只具有其特定的抗生素抗性，對其余3種抗生素均為敏感。見圖3。

2.2.3 工作菌種的工作稀釋度確定 13個(gè)血清型的凍存肺炎鏈球菌工作菌種的稀釋倍數(shù)分別為：1型3333×，3 型 6250×，4 型 2000×，5 型 16666×，6A 型6250×，6B 型 3030×，7F 型 6666×，9V 型 1250×，14 型1250×，18C 型 1470×，19A 型 10000×，19F 型 6250×，23F型6250×，均符合阿拉巴馬大學(xué)標(biāo)準(zhǔn)中稀釋倍數(shù)應(yīng)≥1000的要求。每個(gè)血清型對應(yīng)的稀釋條件下，存活的細(xì)菌數(shù)為80～120 cfu/spot。

圖3 肺炎球菌工作菌種的抗生素抗性及敏感性鑒定

2.3 補(bǔ)體的非特異性殺菌率

經(jīng)計(jì)算，制備的補(bǔ)體非特異性殺菌率：1型為7%，3型為9%，4型為35%，5型為1%，6A型為58%，6B型為57%，7F型為12%，9V型為36%，14型為35%，18C型為1%，19A型為5%，19F型為 4%，23F型為47%。符合阿拉巴馬大學(xué)標(biāo)準(zhǔn)中非特異性殺菌率應(yīng)≤70%的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

2.4 血清樣本的調(diào)理吞噬指數(shù)檢測

2.4.1 殺菌曲線 5份血清樣本的殺菌曲線見圖4。圖中可見，各血清樣本針對各型肺炎球菌的殺菌曲線均為標(biāo)準(zhǔn)的S型曲線。

2.4.2 調(diào)理指數(shù) 經(jīng)菌落計(jì)數(shù)及軟件Opsotiter 3的計(jì)算，各血清樣本的調(diào)理指數(shù)結(jié)果見表1。

3 討論

圖4 5份血清樣本針對各型肺炎球菌的殺菌曲線

OPA實(shí)驗(yàn)中涉及四個(gè)主要元素：效應(yīng)細(xì)胞、靶菌、補(bǔ)體及抗體血清，缺一不可，對于試驗(yàn)的成敗都非常重要。本試驗(yàn)中，效應(yīng)細(xì)胞選用的是HL-60細(xì)胞株（人早幼粒白血病細(xì)胞）。通過懸浮培養(yǎng)，HL-60細(xì)胞能持續(xù)增殖，人為誘導(dǎo)后可以分化為成熟的中性粒細(xì)胞，具有吞噬能力[13]。HL-60細(xì)胞在未分化和分化后表面標(biāo)志物的表達(dá)情況會(huì)發(fā)生變化，如CD71和CD35。CD71蛋白在細(xì)胞增殖中發(fā)揮重要作用，其表達(dá)情況可以指示細(xì)胞的增殖狀態(tài)；CD35是一種跨膜的補(bǔ)體結(jié)合蛋白，存在于成熟的粒細(xì)胞表面，其表達(dá)情況可以顯示細(xì)胞的分化程度。HL-60細(xì)胞未分化之前，CD71的表達(dá)量較高，細(xì)胞具有較強(qiáng)的增殖能力；分化后CD71的表達(dá)量降低，細(xì)胞增殖能力減弱，CD35的表達(dá)量升高，細(xì)胞進(jìn)入分化后的成熟粒細(xì)胞狀態(tài)。利用流式細(xì)胞儀對細(xì)胞表面標(biāo)志物的表達(dá)情況進(jìn)行監(jiān)測，可以實(shí)現(xiàn)對細(xì)胞分化程度的判斷。HL-60細(xì)胞的活性及分化程度越高，吞噬能力越強(qiáng)。

MOPA實(shí)驗(yàn)中的靶菌，是帶有特定抗生素抗性的各型肺炎鏈球菌。將靶菌按抗性不同進(jìn)行分組，每組中的4種靶菌分別攜帶不同的抗性。利用這一特點(diǎn)，可同時(shí)對4種血清型的肺炎球菌進(jìn)行功能抗體檢測。制備工作菌種后，對各型菌種的特定抗生素抗性及敏感性進(jìn)行確認(rèn)非常重要。此外，為了保證試驗(yàn)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性，需要確保對照孔中的活性細(xì)菌數(shù)在70～180 cfu范圍之內(nèi)；因此對工作菌種的凍存活力及工作稀釋度的核實(shí)也必不可少。

補(bǔ)體在OPA實(shí)驗(yàn)中同樣處于重要地位。補(bǔ)體除了與型特異性抗體協(xié)作共同參與調(diào)理吞噬作用之外，其本身還具有一定的非特異性殺菌能力。如果補(bǔ)體自身的非特異性殺菌力太強(qiáng)，會(huì)使特定型別的靶菌被大量殺死，導(dǎo)致試驗(yàn)失敗。因此試驗(yàn)中需要先對補(bǔ)體的非特異性殺菌率進(jìn)行測定，必要時(shí)需要對不同批次補(bǔ)體進(jìn)行篩選。血清樣本在試驗(yàn)前需要進(jìn)行滅活補(bǔ)體的處理，還需要檢測是否含有抗生素，從而排除對試驗(yàn)的干擾。血清樣本恰當(dāng)?shù)念A(yù)稀釋倍數(shù)十分關(guān)鍵，根據(jù)實(shí)際情況需要進(jìn)行調(diào)整，如果預(yù)稀釋倍數(shù)太高，容易導(dǎo)致殺菌不徹底，影響試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，而預(yù)稀釋倍數(shù)太低，則容易導(dǎo)致殺菌率太高，無法檢出具體的調(diào)理滴度。

本研究中，HL-60細(xì)胞檢測結(jié)果顯示，分化5 d后活細(xì)胞比例為72.96%，CD35的表達(dá)量為71.78%，CD71的表達(dá)量為10.97%，符合MOPA參考試驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)要求。工作菌種檢測結(jié)果顯示，工作菌種的凍存活力均高于90%，抗生素抗性與敏感性與預(yù)期結(jié)果一致，工作稀釋度均≥1000，符合標(biāo)準(zhǔn)要求。補(bǔ)體的檢測結(jié)果顯示，非特異性殺菌率均≤70%，符合要求。對5份血清樣本的檢測結(jié)果顯示，兩平行樣本孔間的差異<3倍，殺菌曲線均為標(biāo)準(zhǔn)的S型曲線，符合MOPA試驗(yàn)各項(xiàng)要求。上述結(jié)果表明，本研究已經(jīng)成功建立了MOPA檢測方法。

表1 5份血清樣本的OPA滴度

OPA技術(shù)在國際上已被多個(gè)大型制藥企業(yè)用來進(jìn)行肺炎球菌疫苗的臨床免疫效果評價(jià)，WHO也已推薦使用OPA技術(shù)進(jìn)行疫苗的功能性抗體檢測[14-15]，OPA技術(shù)的應(yīng)用已然成為肺炎疫苗臨床評價(jià)領(lǐng)域的一個(gè)發(fā)展趨勢。本研究在中國食品藥品檢定研究院建立了基于MOPA技術(shù)的肺炎球菌疫苗功能抗體檢測方法，對于促進(jìn)國內(nèi)肺炎疫苗臨床評價(jià)水平的提高有重要意義。

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