王媛媛 曹 建 鄧 莉 陳 勤 歐陽先國

1.南昌市第三醫(yī)院心內(nèi)科，江西南昌 330009；2.南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院麻醉科，江西南昌 330006

烏司他丁是一種廣譜的蛋白水解酶抑制劑，可以抑制體內(nèi)多種蛋白水解酶的活性，調(diào)節(jié)炎癥細胞因子的釋放，減少炎癥細胞浸潤[1]。研究表明氧自由基、鈣超載、心肌纖維能量代謝障礙、中性粒細胞和細胞凋亡等因素均可能參與心肌缺血再灌注損傷心肌的發(fā)病過程[2-3]。本實驗檢測了烏司他丁對缺血再灌注細胞的心肌組織梗死范圍及白細胞介素-6（IL-6）、IL-8的表達，探討烏司他丁對心肌缺血再灌注損傷的保護機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及試劑

取10周左右雄性SD大鼠30只，體重（200±20）g（南昌大學(xué)動物實驗中心提供），烏司他丁注射液，100 000 U/瓶（廣東天普生化醫(yī)藥股份有限公司生產(chǎn)，批號03080806），超氧化物歧化酶 （SOD）和丙二醛（MDA）檢測試劑盒（武漢亞法生物制品有限公司生產(chǎn)），anti-IL-6、anti-IL-8、小鼠單抗辣根酶標記兔抗山羊IgG、anti-β-actin 山羊單抗（SantaCruz產(chǎn)品）。

1.2 分組及模型制作

30只SD大鼠隨機分為3組，分為假手術(shù)組、缺血再灌注（I/R）組、I/R+烏司他丁組，每組各10只。假手術(shù)組，絲線穿過冠狀動脈左室支但不結(jié)扎，經(jīng)尾靜脈注射生理鹽水。I/R組參考趙秀梅等[4]的墊扎球囊法制作大鼠模型。將充盈的球囊（215 mm×10 mm）墊于冠狀動脈前降支與結(jié)扎線之間，用力結(jié)扎，觀察結(jié)扎區(qū)域變白，局部心肌運動減弱，兩個以上導(dǎo)聯(lián)上出現(xiàn)ST段明顯上抬，提示結(jié)扎成功。45 min后將球囊快速抽空便可即刻實現(xiàn)前降支血流再灌注（以心電圖相關(guān)導(dǎo)聯(lián)ST段明顯回落為標準），并持續(xù)再灌注3 h。I/R組，結(jié)扎冠狀動脈后5 min分別通過尾靜脈接受靜脈注射注射生理鹽水，45 min后放松扎線使冠狀動脈再通形成再灌注3 h至實驗結(jié)束；I/R+烏司他丁組結(jié)扎左冠狀動脈左室支前30 min靜脈注射烏司他?。?0 000 U/kg），其余同 I/R 組。

1.3 生化指標檢測

缺血再灌注120 min后自腹主動脈取血6 mL，靜置30 min，4℃3000 r/min離心10 min，離心半徑為5 cm，分離血清。按照試劑盒說明采用化學(xué)比色法測定血清中肌酸激酶同工酶（CK-MB）和MDA、谷胱甘肽（GSH）含量。

1.4 心肌缺血和梗死范圍測定

通過 2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC）染色將心肌切片梗死區(qū)染成灰白色，缺血區(qū)染成磚紅色，非缺血區(qū)染成藍色，掃描后采用圖像分析軟件分別計算各部分的面積。缺血的范圍用缺血心肌面積與左心室面積之比表示，而梗死范圍以梗死心肌面積與缺血心肌面積之比表示。

1.5 Western blot法檢測IL-6、IL-8蛋白水平

分別取適量三組大鼠心肌組織，提取總蛋白，收集上清液，考馬斯亮藍法進行擔(dān)保定量。SDS-PAGE分離樣品后電泳轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜上，洗滌緩沖液（TBST）常溫下封閉過夜后，分別加入小鼠單抗（一抗）、室溫下免疫沉淀1 h，加入辣根酶標記兔抗山羊IgG（二抗）2 h。洗膜，顯色。用 Gel-ProAnalyzer分析軟件分析通道蛋白的灰度值。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 13.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差（±s）表示，多組間比較應(yīng)用單因素方差分析，組間兩兩比較采用q檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組MDA、CK-MB水平比較

與假手術(shù)組比較，I/R組MDA、CK-MB含量明顯增加，GSH含量減少，差異均有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；與I/R組比較，I/R+烏司他丁組MDA、CK-MB含量減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），GSH含量增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

表1 三組肌酸激酶同工酶、丙二醛、谷胱甘肽水平比較（±s）

表1 三組肌酸激酶同工酶、丙二醛、谷胱甘肽水平比較（±s）

注：與假手術(shù)組比較，*P ＜ 0.01；與 I/R 組較，#P ＜ 0.05；I/R：缺血/再灌注；CK-MB：肌酸激酶同工酶；MDA：丙二醛；GSH：谷胱甘肽

組別 只數(shù) CK-MB（U/L）MDA（nmol/L）GSH（mg/L）假手術(shù)組I/R組I/R+烏司他丁組10 10 10 15.21±6.24 2752.21±1276.36*1873.24±621.43#4.13±3.27 11.13±2.13*8.25±4.26#241.42±3.28 184.26±2.14*202.27±4.38#

2.2 心肌缺血范圍和梗死面積

假手術(shù)組未見心肌缺血及梗死，I/R組、I/R+烏司他丁組心肌缺血范圍分別為（49.72±5.36）%、（51.12±6.24）%，兩組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。I/R組梗死面積為（17.12±3.18）%，I/R+烏司他丁組梗死面積為（12.27±4.26）%，兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜ 0.05）。

2.3 心肌組織IL-6、IL-8蛋白表達情況

通過 Western blot法檢測各組 IL-6、IL-8蛋白水平，假手術(shù)組IL-6、IL-8含量較低，缺血再灌注后，I/R組IL-6、IL-8表達升高，兩組比較差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），提示缺血再灌注可以誘導(dǎo)炎性因子IL-6、IL-8釋放；與I/R組比較，I/R+烏司他丁組炎性因子IL-6、IL-8含量下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），提示烏司他丁可以減少炎癥因子表達。見表2。

表2 三組IL-6、IL-8蛋白表達水平比較（±s）

表2 三組IL-6、IL-8蛋白表達水平比較（±s）

注：與假手術(shù)組比較，*P<0.01；與 I/R 組比較，#P<0.05；I/R：缺血/再灌注；IL：白細胞介素

組別 只數(shù) IL-6 IL-8假手術(shù)組I/R組I/R+烏司他丁組10 10 10 0.412±0.550 1.785±0.720*1.102±0.780#0.132±0.071 0.926±0.247*0.672±0.240#

3 討論

烏司他丁能夠廣譜高效抑制多種炎癥因子的釋放，是從健康人尿中提取精制的糖蛋白。研究表明烏司他丁對于消除自由基降低炎性介質(zhì)水平有明顯的作用[5-6]。本實驗通過檢測各項生化指標，I/R組MDA、CK-MB含量明顯增加，GSH含量減少，I/R+烏司他丁組MDA、CK-MB含量明顯減少，GSH含量增加，提示烏司他丁可能通過增加GSH含量，清除過氧化物代謝，從而減少細胞氧化損傷，對缺血再灌注心肌損傷具有保護作用。

心肌缺血再灌注損傷中，氧自由基的釋放及抗氧化酶活性降低，可導(dǎo)致心肌細胞嚴重受損[7]。同時炎癥因子也占有重要地位，心肌早期缺血、缺氧所造成的炎性反應(yīng)又可促進單核-巨噬細胞大量釋放白細胞介素，后者作為一種強特異性的中性粒細胞趨化因子，進一步促進中性粒細胞的聚集，并促使中性粒細胞釋放細胞毒性產(chǎn)物，加重炎性反應(yīng)，損害心肌細胞[8-10]。炎癥因子水平的高低和缺血后心臟功能的損害及細胞壞死數(shù)量的多少直接相關(guān)，說明炎性反應(yīng)在心肌缺血再灌注損傷中起了非常重要的作用。

IL-8主要由單核巨噬細胞分泌，其他如血管內(nèi)皮細胞、淋巴細胞等也能產(chǎn)生IL-8。目前，對于IL-8參與心肌缺血再灌注損傷的研究頗多，動物實驗發(fā)現(xiàn)心肌缺血和缺血再灌注后血中IL-8平均明顯升高。IL-6一直以來被認為是參與急性期反應(yīng)的Th2類細胞因子，實驗發(fā)現(xiàn)心肌組織IL-6含量在缺血再灌注后有顯著性增加[11-14]。本實驗通過檢測烏司他丁處理后IL-6、IL-8蛋白表達，與假手術(shù)組比較，I/R組IL-6，IL-8升高；與I/R組比較，烏司他丁組IL-6，IL-8表達降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），并且CK-MB及心肌梗死面積下降，提示烏司他丁可以通過抑制炎性反應(yīng)，降低炎癥因子表達，減少心肌細胞氧化損傷的途徑，減輕心肌缺血再灌注損傷，其機制有待于進一步臨床試驗論證。

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