周波林

廣西壯族自治區(qū)北海市人民醫(yī)院藥劑科，廣西北海 536000

地西泮（Diazepam）是臨床上常用的鎮(zhèn)靜、催眠、抗驚厥藥，在體內(nèi)主要經(jīng)肝臟細(xì)胞色素P450酶作用進(jìn)行氧化代謝，具有遺傳多態(tài)性和東西方人種之間的差異，臨床上地西泮常用于控制肌痙攣和抽搐，如破傷風(fēng)、癲癇發(fā)作、局部麻醉等，大劑量可引起外周神經(jīng)肌肉阻斷、呼吸抑制等不良反應(yīng)，嚴(yán)重者可導(dǎo)致死亡[1]。該藥物不但臨床應(yīng)用廣泛，而且也是急診藥物中毒和自殺患者的常服藥物。

此類藥物在中毒藥物中居首位，是因?yàn)榈匚縻幋鷮W(xué)參數(shù)個(gè)體差異明顯、治療指數(shù)范圍小，藥物過(guò)量的典型表現(xiàn)有差異，而且藥物中毒的發(fā)生和嚴(yán)重的程度與血藥濃度呈正相關(guān)[2]，因此監(jiān)測(cè)其血藥濃度對(duì)臨床治療和中毒搶救均有重要意義。目前，對(duì)地西泮血藥濃度檢測(cè)的研究報(bào)道多為高效液相色譜法[3-5]，紫外導(dǎo)數(shù)光譜法檢測(cè)地西泮血藥濃度未見報(bào)道，本文建立了簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確地測(cè)定血漿中地西泮濃度的新方法——紫外導(dǎo)數(shù)光譜法，為地西泮的血藥濃度監(jiān)測(cè)與藥動(dòng)學(xué)研究提供了新的分析手段。

1 儀器與試藥

儀器MV-1201型雙光束紫外可見分光光度計(jì)（北京瑞利分析儀器公司）；BP-21lD型電子天平（德國(guó)SARTORIMS公司）；超聲波發(fā)生器（上海 SBS2200）；地西泮化學(xué)對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定所提供）；水為超純水；甲醇（分析純）；純化水由廣西壯族自治區(qū)北海市人民醫(yī)院（以下簡(jiǎn)稱“我院”）檢驗(yàn)科提供；血漿由我院輸血科提供。

2 方法與結(jié)果

2.1 測(cè)定條件及吸收光譜的選擇

2.1.1 溶液的制備

2.1.1.1 血漿樣品溶液的制備 將地西泮對(duì)照品適量在105℃下，干燥至恒重，精密稱取10.61 mg，置于100 mL容量瓶中，加入甲醇適量，振蕩2～3 min，加甲醇試劑至刻度，制得地西泮貯備溶液。精密量取地西泮貯備溶液2 mL，置于10 mL量瓶中，用空白血漿（陰性對(duì)照液）稀釋至刻度，即得（含地西泮約21.22 μg/mL）。

2.1.1.2 地西泮對(duì)照品溶液的制備 將地西泮對(duì)照品適量在105℃下，干燥至恒重，精密稱取10.61 mg，置于100 mL容量瓶中，加入甲醇適量，振蕩2～3 min，加甲醇試劑至刻度，制得地西泮貯備溶液，備用。精密量取地西泮標(biāo)準(zhǔn)貯備液適量，制備地西泮對(duì)照品溶液（濃度：21.22 μg/mL）。

2.1.1.3 陰性對(duì)照液的制備 精密吸取空白血漿適量，加入3倍量甲醇沉淀蛋白，振蕩3 min，12 000 r/min離心10 min，取上清液備用。

2.1.2 零階紫外掃描光譜

分別將血漿樣品溶液（a液，含地西泮約21.22μg/mL），地西泮對(duì)照品溶液（b 液，濃度：21.22 μg/mL），陰性對(duì)照液（c液，空白血漿）進(jìn)行紫外光譜掃描，波長(zhǎng)范圍為190～400 nm。光譜掃描條件：光度模式為Abs，掃描模式為單一，掃描速度為快速，光譜帶寬為2 nm，采樣間隔為0.1 nm。見圖1。

從圖1可以觀察到，空白血漿與地西泮之間的紫外吸收有重疊，干擾較大，利用紫外分光光度法無(wú)法直接測(cè)定血漿中地西泮的含量。

圖1 各溶液的零階紫外光譜

2.1.3 一階導(dǎo)數(shù)光譜及測(cè)定波長(zhǎng)的選擇

取“2.1.2”項(xiàng)下 a、b、c 溶液，進(jìn)行紫外光譜掃描，波長(zhǎng)范圍為190～400 nm。對(duì)掃描后的紫外光譜進(jìn)行導(dǎo)數(shù)微積分轉(zhuǎn)換，分別得到3種溶液的一階導(dǎo)數(shù)光譜。掃描條件同“2.1.2”項(xiàng)下，微分波長(zhǎng)差為10；縮放系數(shù)為1。見圖2。

由圖2可見：血漿樣品溶液（a液）在240.0 nm波長(zhǎng)處的谷-零振幅圖譜與地西泮對(duì)照品溶液（b液）相一致，而空白血漿（c液）在此波長(zhǎng)處的谷-零振幅值為0，因此，測(cè)定地西泮血藥濃度的檢測(cè)波長(zhǎng)可以定為240.0 nm。

2.2 線性關(guān)系考察

精密吸取地西泮標(biāo)準(zhǔn)貯 備液 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL，分別置于10 mL容量瓶中，加入甲醇稀釋至刻度，制成濃度（C）為 5.35～31.85 μg/mL 的系列工作液，以甲醇為空白對(duì)照，在240.0 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其一階導(dǎo)數(shù)光譜的振幅值D，以濃度C對(duì)D進(jìn)行線性回歸，得回歸方程：D=1.241×10-3C+3.0706×10-4（r=0.9979）。表明地西泮在 5.35～31.85 μg/mL 濃度范圍內(nèi)，其一階導(dǎo)數(shù)振幅值D與濃度C呈良好線性關(guān)系[6]。

2.3 回收率試驗(yàn)

精密吸取按“2.1.1.3”項(xiàng)下制備的陰性對(duì)照液5 mL，分別精密加入濃度為 25.75 μg/mL的地西泮 5、10、15、20、25、30 mL，混勻，按照“2.2”項(xiàng)下測(cè)定 D 值，以D值代入回歸方程計(jì)算含量，結(jié)果見表1。

2.4 精密度試驗(yàn)

取地西泮對(duì)照品溶液適量，在波長(zhǎng)240.0 nm處重復(fù)測(cè)定地西泮一階導(dǎo)數(shù)光譜的谷-零振幅D值，D值為 0.0274、0.0266、0.0278、0.0269、0.0273，RSD 為1.70%（n＝5），精密度符合規(guī)定。

2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取血漿樣品溶液按“2.1.1.1”項(xiàng)下配制后室溫放置 0、1、2、4、6 h 后，分別于波長(zhǎng) 240.0 nm 處測(cè)定谷-零振幅 D 值，D 值為 0.0405、0.0391、0.0387、0.0388、0.0376，RSD為2.67%（n=5），說(shuō)明在6 h內(nèi)血漿樣品穩(wěn)定性較好，對(duì)檢測(cè)結(jié)果沒有產(chǎn)生不良影響。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

取相同濃度血漿樣品5份，按“2.2”項(xiàng)下測(cè)定谷-零振幅D值，以D值代入回歸方程計(jì)算含量，分別為26.50、26.18、27.30、27.06、25.93， 各樣品中地西泮含量的平均值分別為26.48 μg/mL，RSD分別為2.18%（n＝5）。

3 討論

地西泮治療參數(shù)個(gè)體差異大、治療范圍小，而且藥物中毒的發(fā)生和嚴(yán)重的程度與血藥濃度呈正相關(guān)，因此，檢測(cè)其血藥濃度對(duì)臨床治療和中毒搶救均有重要意義。為了確保藥物治療的安全、有效，必須建立一種簡(jiǎn)單、靈敏、準(zhǔn)確的地西泮血藥濃度測(cè)定方法。

圖2 各溶液的一階導(dǎo)數(shù)光譜

表1 地西泮樣品溶液回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）

3.1 檢測(cè)方法的選擇

紫外吸收光譜是由價(jià)電子的躍遷而產(chǎn)生的，由于具有不同分子結(jié)構(gòu)的物質(zhì)具有不同的官能團(tuán)，因此會(huì)有選擇性地吸收不同波長(zhǎng)的光，這樣就會(huì)產(chǎn)生吸收光譜的差異。因此物質(zhì)的分子或離子產(chǎn)生的紫外光譜及吸收程度可以對(duì)物質(zhì)的組成、含量和結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析、測(cè)定、推斷。紫外導(dǎo)數(shù)光譜是利用不同物質(zhì)紫外吸收不同的原理，通過(guò)對(duì)紫外光譜進(jìn)行微積分求導(dǎo)，達(dá)到清除物質(zhì)相互干擾的目的，能夠?qū)旌衔锖蛷?fù)雜組分直接進(jìn)行檢測(cè)。目前，新型的紫外分光光度計(jì)均可利用紫外-可見分光光度計(jì)軟件系統(tǒng)帶有的數(shù)學(xué)處理功能，對(duì)吸收光譜進(jìn)行處理，可以獲得導(dǎo)數(shù)光譜。通?？梢垣@得1～4階導(dǎo)數(shù)光譜，在各階導(dǎo)數(shù)光譜中，吸光度對(duì)波長(zhǎng)的微分值與溶液中組分的濃度C保持線性關(guān)系，其中s為導(dǎo)數(shù)的階數(shù)，通過(guò)電子學(xué)獲得模擬導(dǎo)數(shù)光譜圖，使其應(yīng)用更加簡(jiǎn)化、普遍化[7]。

3.2 測(cè)定波長(zhǎng)的選擇

本實(shí)驗(yàn)在選定波長(zhǎng)時(shí)，對(duì)所檢測(cè)的溶液在200～400 nm范圍內(nèi)進(jìn)行光譜掃描，可以觀察到，空白血漿與地西泮之間的紫外吸收有重疊，干擾較大，利用紫外分光光度法無(wú)法直接測(cè)定血漿中地西泮的含量。通過(guò)導(dǎo)數(shù)光譜筆者發(fā)現(xiàn)血漿樣品溶液（a液）在240.0 nm波長(zhǎng)處的谷-零振幅圖譜與地西泮對(duì)照品溶液（b液）的相一致，而空白血漿（c液）在此波長(zhǎng)處的谷-零振幅值為0，因此，測(cè)定地西泮血藥濃度的檢測(cè)波長(zhǎng)可以定為240.0 nm。

3.3 血漿蛋白沉淀劑的選擇

本文在參考現(xiàn)有文獻(xiàn)[8-10]報(bào)道的基礎(chǔ)上，結(jié)合本單位現(xiàn)有設(shè)備條件，優(yōu)化了血樣處理方法：以甲醇代替乙腈，試劑價(jià)格相對(duì)低廉；以3倍血樣量的甲醇為蛋白沉淀劑，輔以較高轉(zhuǎn)速離心的方法處理血樣，蛋白沉淀效果好，提取回收率高，適合紫外導(dǎo)數(shù)光譜測(cè)定地西泮血藥濃度時(shí)使用。

3.4 方法學(xué)研究

線性化范圍試驗(yàn)也叫標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制，實(shí)際是樣品濃度（樣品量）與響應(yīng)值（吸光度、色譜峰或峰高、振幅）之間的線性關(guān)系，根據(jù)最小二乘法原理確定回歸方程，判斷回歸方程是否有意義，主要靠相關(guān)系數(shù)（r）來(lái)判斷，一般要求r在0.995以上。本實(shí)驗(yàn)利用6個(gè)濃度點(diǎn)，制定了線性方程[11]：D=1.241×10-3C+3.0706×10-4，r=0.9979，這表明地西泮在5.35～31.85 μg/mL濃度范圍內(nèi)，其紫外導(dǎo)數(shù)光譜振幅值D與濃度C呈良好線性關(guān)系，該回歸方程可用于紫外導(dǎo)數(shù)光譜測(cè)定地西泮血藥濃度。

回收率試驗(yàn)也叫加樣回收率試驗(yàn)，是衡量誤差或準(zhǔn)確度的一種方法，是向試樣中加入已知量的被測(cè)成分，然后進(jìn)行對(duì)照試驗(yàn)，觀察加入的被測(cè)組分能否定量回收，以此判斷分析過(guò)程是否存在系統(tǒng)誤差，加樣回收率一般要求在95%～105%之間為宜[12]，本實(shí)驗(yàn)平均回收率是100.85%，符合實(shí)驗(yàn)要求。

精密度是指用相同方法對(duì)同一試樣進(jìn)行多次測(cè)定，各測(cè)量值彼此接近的程度。精密度用標(biāo)準(zhǔn)偏差（S）和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）來(lái)表示[13]，本實(shí)驗(yàn)精密度的RSD 為 1.70%（n＝5），符合實(shí)驗(yàn)要求。

重復(fù)性試驗(yàn)是指在同一實(shí)驗(yàn)室，由同一操作者使用相同的設(shè)備，按相同的試驗(yàn)方法，在短時(shí)間內(nèi)對(duì)同一試樣（或元件）相互獨(dú)立進(jìn)行的試驗(yàn)結(jié)果間的一致性[14]。 本實(shí)驗(yàn)精密度的RSD 為2.18%（n＝5），符合實(shí)驗(yàn)要求。

可見，本實(shí)驗(yàn)建立的方法，樣品處理簡(jiǎn)單，操作方便，約10 min即可完成一個(gè)樣品的分析，分析成本低。吸收峰與血漿藥物濃度之間的線性關(guān)系良好，專屬性強(qiáng)，精密度和準(zhǔn)確度高，穩(wěn)定可靠，為地西泮的藥代動(dòng)力學(xué)研究提供了可靠的分析方法，對(duì)開展地西泮藥代動(dòng)力學(xué)研究及治療藥物濃度監(jiān)測(cè)有著重要意義，可供藥代動(dòng)力學(xué)研究及臨床血藥濃度檢測(cè)使用。

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