賀有周 劉 云 劉 鵬 馮 文 袁立華

(四川大學化學學院,原子核科學技術(shù)研究所,輻射物理及技術(shù)教育部重點實驗室,成都 610064）

1 引言

囊泡因其在生物模擬、1-3納米材料4-6以及藥物和基因傳遞7-10等方面的重要意義而受到日益廣泛關(guān)注.早期的研究主要是通過磷脂分子、11表面活性劑12,13和嵌段共聚物14等作為主體分子來設(shè)計和構(gòu)筑囊泡體系.隨著超分子化學的深入發(fā)展,相繼出現(xiàn)了以杯芳烴、15,16葫蘆脲、17環(huán)糊精18,19和芳酰胺分子20-23等為主體的自組裝超分子囊泡體系.

近年來發(fā)展起來了一類結(jié)構(gòu)獨特的寡聚芳酰胺分子,是基于多重氫鍵作用形成自互補或異互補雙股分子鏈.24-27利用這種雙股分子鏈,可構(gòu)筑超分子二嵌段共聚物28或者有效地提高有機反應的產(chǎn)率.29近幾年我們報道了一種基于四重氫鍵寡聚芳酰胺雙股分子鏈的凝膠,通過改變側(cè)鏈可以對凝膠的穩(wěn)定性和組裝形貌等進行調(diào)控;30設(shè)計了一系列可以通過改變氫鍵結(jié)合位點間距來調(diào)控結(jié)合強度和專一性的寡聚萘芳酰胺分子鏈;31并用含有端烯烴的寡聚芳酰胺分子,在Grubbs催化劑的催化下形成了基于氫鍵和烯烴復分解共價偶聯(lián)的拉鏈分子;32發(fā)現(xiàn)了基于六重氫鍵異互補寡聚芳酰胺雙股分子鏈構(gòu)建的氫鍵型超分子接枝共聚物可以存在于中等極性的溶劑環(huán)境中;33探討了基于酰胺和脲結(jié)構(gòu)的自互補和異互補兩類新型的四重氫鍵結(jié)合單元,及其吸電效應、預組織效應以及位阻效應等對結(jié)合能力的影響.34,35我們已研究了氫鍵編碼順序為ADAADA-ADAADA的寡聚芳酰胺分子2,能組裝成微納米實心球;36而我們在設(shè)計合成與其能互補配對的氫鍵編碼順序為DADDAD-DADDAD的寡聚芳酰胺分子1時,意外地發(fā)現(xiàn)其能自組裝成囊泡結(jié)構(gòu).

本文首先合成了寡聚芳酰胺分子1,并用SEM、TEM和DLS等手段研究了其形成囊泡的自組裝行為,以及加入異互補分子2后的形貌變化,并運用熒光顯微鏡探討了其包裹性能.

2 實驗部分

2.1 試劑和儀器

采用CaH2對CH2Cl2進行干燥;其它試劑均為市售分析純,除特殊說明外直接使用.儀器使用日本日立公司Hitachi S-450型掃描電鏡(加速電壓為20 kV）;日本電子株式會(JEOL）的JEM-100CX型透射電鏡(加速電壓為80 kV）;美國Brookhaven公司Malvern Zetasizer Nano S動態(tài)光散射儀,掃描角度為90°,采用氦氖激光光源(532 nm）;Bruker AV II-400 MHz和Bruker AV II-600 MHz核磁共振波譜儀;日本SHIMADZU公司生產(chǎn)的UV-2450型號的紫外可見分光光度計;日本尼康公司生產(chǎn)的型號為Nikon Eclipse Ti-E倒置熒光顯微鏡.

2.2 寡聚芳酰胺自組裝測試制樣方法

先配成一定濃度的四氫呋喃/甲醇溶液(5.00 mmol·L-1）或者丙酮溶液(0.10-5.00 mmol·L-1）,加熱至50°C搖勻,冷卻至室溫,靜置1 h滴加到云母上,溶劑自然揮發(fā)干燥后進行SEM測試.TEM制樣方法:配成0.20 mmol·L-1的丙酮溶液,加熱至50 °C,震蕩搖勻,冷卻至室溫,靜置1 h,用滴管吸取溶液滴于純碳膜銅網(wǎng)上,用濾紙吸去余液,在45°C下真空干燥2 h后滴加磷鎢酸(質(zhì)量分數(shù)為2%）進行染色,5 min后吸去多余的染液,烘干進行測試.

DLS測試制樣采用丙酮,配制成一定濃度的溶液,用孔徑為220 nm的過濾篩進行過濾.測試溫度25°C,入射光波長532 nm,掃描時間3 min,掃描角度90°.

2.3 囊泡熒光染料包裹測試制樣方法

將化合物1和羅丹明B按照相同物質(zhì)的量的濃度(0.5 mmol·L-1）溶解于3 mL四氫呋喃/甲醇(體積比為95/5）混合溶劑中,加熱到60°C,冷卻至室溫形成澄清的溶液,然后轉(zhuǎn)移至透析袋(截留分子量MW(CO）=3500）中,用1 L四氫呋喃/甲醇溶劑透析三天后,得到的溶液再用四氫呋喃/甲醇溶劑稀釋后進行熒光測試.

2.4 合成路線

化合物1的合成路線見示意圖1.

2.5 合成步驟

2.5.1 化合物3的合成

化合物3參照以前發(fā)表的文獻37,38進行合成.

2.5.2 化合物1的合成

將0.70 g(0.74 mmol）化合物3溶于四氫呋喃中,加入0.14 g Pd/C氫氣還原,得到的產(chǎn)品直接進行下步反應.將64.4 mg(0.37 mmol）辛二酸和189.0 mg(1.50 mmol）草酰氯溶于干燥的二氯甲烷中,加10μL N,N-二甲基甲酰胺(DMF）,室溫反應.在冰浴的條件下,滴加到含有化合物3的還原生成的677.0 mg(0.74 mmol）胺和182.0 mg(1.8 mmol）三乙胺的二氯甲烷溶液中,室溫攪拌過夜.柱層析分離(V(CHCl3）/V(CH3OH）=30/1）得到淺黃色固體產(chǎn)物(0.55 g,76%）.核磁共振氫譜(1H NMR）(600 MHz,DMSO-d6）:δ 10.37(s,4H）,9.94(s,2H）,9.88(s,2H）,8.55(t,J=5.2 Hz,4H）,8.10(s,2H）,8.08-8.04(m,8H）,7.87-7.72(m,4H）,7.16(dd,J=9.1,4.7 Hz,4H）,4.26-4.17(m,12H）,4.05-3.97(m,8H）,2.33-2.24(m,4H）,2.03(s,6H）,1.85(m,4H）,1.68(m,2H）,1.65-1.54(m,4H）,1.54-1.23(m,52H）,0.94-0.77(m,36H）.13C NMR(100 MHz,DMSO-d6）:δ 171.43,168.44,167.95,165.99,164.96,164.93,153.14,153.10,139.92,134.55,133.15,131.26,124.13,124.06,122.33,122.26,121.93,115.31,114.49,113.96,79.64,72.31,67.16,63.10,46.08,44.04,38.97,38.78,36.71,34.82,34.14,33.97,31.74,30.89,30.45,30.34,29.48,29.15,28.93,28.85,25.52,24.96,24.23,23.88,23.75,22.95,22.84,22.53,14.29,14.27,11.29,11.25,9.03.HRESIMS(m/z）計算值[C110H158N12O20+H]+1969.1827,實驗值:1969.1859;計算值[C110H158N12O20+Na]+1991.1647,實驗值:1991.1689.

示意圖1 寡聚芳酰胺1的合成路線Scheme 1 Synthetic route of oligoaramide 1 THF:tetrahydrofuran

3 結(jié)果與討論

3.1 自組裝囊泡形貌分析

將化合物1溶于四氫呋喃溶劑中,滴加到云母片上并干燥,通過SEM觀察沒有發(fā)現(xiàn)其組裝形貌.Zang課題組39曾報道適當添加不良溶劑有利于自組裝發(fā)生.于是向良溶劑四氫呋喃中加入5%的不良溶劑甲醇制樣,驚訝地發(fā)現(xiàn)其組裝形成了球形結(jié)構(gòu)(圖1）,但其形狀不太規(guī)整,微球上有小孔,暗示其可能為囊泡結(jié)構(gòu);加入15%(w）的甲醇時,得到了較為規(guī)整的球形結(jié)構(gòu),微球上同樣存在小孔;加入30%的甲醇時,發(fā)現(xiàn)微球上的小孔明顯增多;當加入50%的甲醇時,分散的微球開始連在了一起,有的形成了整塊的膜狀結(jié)構(gòu).溶劑組成改變對組裝結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了影響,適當添加不良溶劑甲醇有利于自組裝發(fā)生.

改用丙酮作為溶劑,化合物1也能組裝成大小較均勻的球形結(jié)構(gòu)(圖2）,與混合溶劑中的情況一樣,球狀物上也有小孔,表明此球狀物很可能為囊泡結(jié)構(gòu).當濃度為0.10 mmol·L-1時,囊泡的平均直徑大約變?yōu)榱?.48 μm;當濃度增加到0.25 mmol·L-1時,囊泡的平均直徑也增大為0.50 μm;當濃度進一步增加到5.00 mmol·L-1時,囊泡的平均直徑變?yōu)榱?.18 μm.這說明了溶液濃度對囊泡大小的影響,濃度越濃囊泡越大.

TEM實驗發(fā)現(xiàn)(圖3）,球體中間顏色淺、邊沿深,進一步證實其為囊泡結(jié)構(gòu),直徑在250 nm左右.囊泡的壁厚為3.0 nm左右,這與其雙分子層囊泡模型(CPK）計算值2.6 nm十分接近,推測囊泡表現(xiàn)為雙分子層結(jié)構(gòu).

3.2 化合物1的核磁共振氫譜1H NMR分析

圖1 化合物1(5.0 mmol·L-1）在四氫呋喃/甲醇不同比例混合溶劑中的掃描電鏡圖Fig.1 SEM images of compound 1(5.0 mmol·L-1）in tetrahydrofuran/methanol volume ratio of tetrahydrofuran/methanol:(a）95/5;(b）85/15;(c）70/30;(d）50/50

圖2 不同濃度化合物1在丙酮中的掃描電鏡圖Fig.2 SEM images of compound 1 with different concentrations in acetone

圖3 化合物1在丙酮中的透射電鏡圖(磷鎢酸染色）Fig.3 TEM images of compound 1 in acetone(phosphotungstic acid staining）

圖4 化合物1(5 mmol·L-1）在不同溶劑中的局部疊加1H NMR譜圖Fig.4 Stacked partial1H nuclear magnetic responance(1H NMR）spectra of compound 1(5 mmol·L-1）in different solutions

通過變極性核磁研究了化合物1的聚集行為.實驗結(jié)果(圖4）表明:在弱極性溶劑氯仿中,化合物1呈現(xiàn)出很寬的峰,可能是由于分子間氫鍵作用形成了超分子聚合物導致聚集作用非常強;在中等極性溶劑丙酮中,化合物1的峰開始變得較為清晰,分子間氫鍵作用被削弱了,從而導致超分子聚合物的聚合能力減弱了;在強極性溶劑二甲基亞砜(DMSO）中,分子間的氫鍵作用徹底被破壞了,化合物1峰形變得非常尖銳.所以通過變極性核磁實驗暗示化合物1在丙酮中可能形成了超分子聚合物或者超分子寡聚體.

二維核磁共振(2D NOESY）實驗是研究化合物1是否發(fā)生自組裝的一種很好的方法.2D NOESY實驗(圖5）顯示,苯環(huán)質(zhì)子j和亞甲基質(zhì)子d之間有明顯的相互作用,說明化合物1通過氫鍵作用發(fā)生了自組裝,可能形成了線性超分子寡聚體或聚合物.TEM實驗已經(jīng)推測囊泡為雙分子層結(jié)構(gòu),化合物1自組裝形成囊泡可能的組裝模型如圖6所示.

圖5 化合物1的二維核磁(2D NOESY）譜圖Fig.5 Partial two-dimensional nuclear overhauser enhancement(2D NOESY）spectra of compound 1

3.3 自組裝囊泡動態(tài)光散射(DLS）分析

DLS實驗進一步提供了化合物1在溶液狀態(tài)中發(fā)生自組裝的證據(jù)(圖7）.新配制的溶液經(jīng)靜置2 h后,平均粒徑為229.0 nm,這與TEM實驗發(fā)現(xiàn)的囊泡直徑在250 nm左右相近;而靜置24 h,平均粒徑增大到383.0 nm左右.靜置的時間越久其粒徑越大,說明化合物在丙酮中的聚集程度隨著靜置時間的延長而加強,這可能是囊泡相互融合造成的.

圖6 化合物1自組裝形成囊泡的示意圖Fig.6 Schematic representation of self-assembled vesicles of compound 1

圖7 化合物1(0.2 mmol·L-1）在丙酮中的動態(tài)光散射(DLS）圖Fig.7 Dynamic laser scattering(DLS）patterns of compound 1(0.2 mmol·L-1）in acetone(a）2 h;(b）24 h

圖8 化合物2的結(jié)構(gòu)36Fig.8 Structure of compound 236

圖9 (a）復合物1·2的掃描電鏡圖;(b）復合物1·2的透射電鏡圖Fig.9 (a）SEM image of complex 1·2;(b）TEM image of complex 1·2

3.4 自組裝形貌調(diào)控

加入等物質(zhì)的量的異互補鏈2(圖8）,對自組裝形貌進行調(diào)控.通過SEM(圖9(a））發(fā)現(xiàn),復合物1·2自組裝形成了球狀物,但與化合物1形成的囊泡相比較,其球形結(jié)構(gòu)上沒有出現(xiàn)小孔,暗示此球狀物可能為實心球.通過TEM(圖9(b））證實其球狀物的確為實心結(jié)構(gòu).當加入異互補分子2后,對自組裝形貌產(chǎn)生了影響,使囊泡轉(zhuǎn)變成了實心球,達到了自組裝形貌調(diào)控的目的.

圖10 化合物1(0.005 mmol·L-1）和化合物2(0.005 mmol·L-1）及其復合物1·2(0.005 mmol·L-1）在氯仿中的紫外-可見光譜Fig.10 UV-Vis absorption spectra of compounds 1(0.005 mmol·L-1）,2(0.005 mmol·L-1）and complex 1·2(0.005 mmol·L-1）in CHCl3

圖11 化合物1(C）和化合物2(A）及其復合物1·2(B）的薄層色譜圖Fig.11 Thin-layer chromatography(TLC）of compounds 1,2(C,A）and complex 1·2(B）

圖12 復合物1·2的組裝模式示意圖Fig.12 Illustration of complex 1·2

圖13 化合物1自組裝囊泡包裹羅丹明B的熒光顯微鏡圖Fig.13 Fluorescence microscopy image of Rhodamine B-entrapped vesicles of compound 1

紫外測試顯示(圖10）,復合物1·2的吸光度遠大于化合物1和2的吸光度,并非簡單二者強度的加和,且觀察到復合物1·2的最大吸收峰有紅移現(xiàn)象發(fā)生,說明通過氫鍵配對的化合物1和2之間發(fā)生了自組裝.

在對化合物1和2及其復合物1·2進行薄層色譜(TLC）板檢測時,發(fā)現(xiàn)了一個更直接的證據(jù).如圖11所示,復合物1·2(點B）在TLC板上顯示了與化合物1(點C）和化合物2(點A）不同的比移值(Rf）.復合物1·2在TLC板上形成的新點直觀地說明了復合物1·2自組裝體的形成.

加入的互補化合物2和化合物1可能形成了如圖12所示的二聚體結(jié)構(gòu),使其不能再形成線性的超分子寡聚體或聚合物,二聚體再通過側(cè)鏈的范德華力與苯環(huán)之間的ππ堆積作用聚集在一起,從而形成了實心球.

3.5 囊泡包裹性能

為了進一步對囊泡進行研究,我們運用熒光顯微鏡探討了其包裹性能.實驗表明(圖13）化合物1自組裝成的囊泡結(jié)構(gòu)可以很好地包裹熒光分子(羅丹明B）,可以看到其包裹的羅丹明B分子.

4 結(jié)論

合成了氫鍵編碼順序為DADDAD-DADDAD的寡聚芳酰胺分子1,通過SEM和TEM對其自組裝形貌進行了研究,發(fā)現(xiàn)化合物1組裝結(jié)構(gòu)會受到混合溶劑比例改變的影響,在四氫呋喃溶劑中沒有發(fā)現(xiàn)其組裝形貌,當適當加入不良溶劑甲醇有利于自組裝發(fā)生,加入15%的甲醇得到了較為規(guī)整的囊泡結(jié)構(gòu);分子1也能在單一溶劑丙酮中組裝成大小均勻的雙分子層囊泡結(jié)構(gòu).DLS實驗表明在丙酮中的聚集程度隨著靜置時間的延長而加強.通過加入異互補分子2(ADAADA-ADAADA）對自組裝形貌進行調(diào)控,使囊泡轉(zhuǎn)變成了實心球結(jié)構(gòu).最后運用熒光顯微鏡證實化合物1自組裝成的囊泡結(jié)構(gòu)可以很好地包裹熒光分子(羅丹明B）.本文提供了一種通過含多重氫鍵的寡聚芳酰胺體系構(gòu)筑囊泡的方法,通過進一步分子結(jié)構(gòu)修飾,有可能實現(xiàn)在藥物包埋和釋放方面的應用.

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