馮智慧 趙林 劉曉華 焦淑賢 陳鵬

通過抑制新生血管的形成來治療腫瘤，已經(jīng)成為腫瘤治療的新策略［1-2］。角膜本身無(wú)血管，因此實(shí)驗(yàn)中只要發(fā)現(xiàn)血管就可以認(rèn)為是新生血管，可避免其他模型中原有血管的干擾，能真實(shí)地反映血管生成過程［3］。我們前期在小鼠角膜新生血管模型中，通過基因表達(dá)譜芯片發(fā)現(xiàn)與膜-細(xì)胞骨架連接蛋白家族結(jié)合的磷酸化蛋白50(ezrin-radixin-moesinbinding phosphoprotein 50，EBP50)在血管新生過程中表達(dá)明顯上調(diào)［4］。目前，關(guān)于EBP50在腫瘤新生血管中的作用及其機(jī)制尚未見報(bào)道，本研究將通過在人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVEC)內(nèi)過量表達(dá)EBP50蛋白，研究其對(duì)人血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移及成管功能的影響及可能的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

DMEM培養(yǎng)基(美國(guó)Invitrogen公司)，胰蛋白酶(美國(guó)Gibco公司)，辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG抗體(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)，小鼠抗GAPDH抗體(上?？党缮锕こ逃邢薰?，Westren Blot發(fā)光劑(美國(guó) Thermo公司)，F(xiàn)ITC-Phalloidin(鬼筆環(huán)肽)(美國(guó) Sigma公司)，PAkt1抗體及HA抗體(美國(guó)Cell Signaling Technology公司)，Akt1抗體(美國(guó)Abcam公司)。

1.2 真核表達(dá)載體的構(gòu)建

提取HUVEC的RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，應(yīng)用以下引物擴(kuò)增EBP50的全長(zhǎng)序列，并在擴(kuò)增的序列兩端引 入 EcoRI和 XhoI酶 切 位 點(diǎn) forward:AGAGAATTCAGCGCGGACGCAGCGG; reverse:CCGCTCGAGTCAGAGGTTGCTGAAGAGT，將表達(dá)載體pBK-CMV-HA和擴(kuò)增的EBP50的全長(zhǎng)序列分別用EcoRI和XhoI雙酶切成粘端，凝膠電泳后切膠回收，連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，抗性篩選。獲取陽(yáng)性克隆后，提取質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，確證所得的 pBKCMV-HA-EBP50陽(yáng)性克隆具有正確的序列及讀碼框。

1.3 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系的建立及鑒定

HUVEC在含10%小牛血清的DMEM-F12培養(yǎng)基中，于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。以2 μg重組質(zhì)粒DNA通過脂質(zhì)體(HifectinII)介導(dǎo)轉(zhuǎn)染HUVEC，用含有濃度為 400 μg/ml G418(Geneticin，慶大霉素的氨基糖苷)的篩選培養(yǎng)基篩選3～4周后得到抗性細(xì)胞克隆。消化分離后用G418的維持培養(yǎng)基(200 μg/ml)進(jìn)行培養(yǎng)和傳代。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pBK-CMV-HA-EBP50的HUVEC細(xì)胞株命名為EBP50-HUVEC，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pBK-CMV-HA的HUVEC細(xì)胞株命名為HA-HUVEC。分別將兩種細(xì)胞接種于60 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿，待細(xì)胞貼壁并生長(zhǎng)至密度約80%后，分別提取細(xì)胞總蛋白，應(yīng)用Western blot方法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)目的蛋白的含量:通過HA抗體檢測(cè)外源性轉(zhuǎn)入的EBP50蛋白的表達(dá)水平，用Image J圖像分析系統(tǒng)對(duì)Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行掃描分析。

1.4 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖

將兩種穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后的HUVEC分別消化成細(xì)胞懸液，將細(xì)胞按照1 ×103個(gè)/孔，每孔200 μl接種至96孔板中，培養(yǎng)板置37℃培養(yǎng)，每隔24 h分別取每組細(xì)胞的3個(gè)復(fù)孔，每孔中加入20 μg MTT，繼續(xù)培養(yǎng) 4 h，然后吸出培養(yǎng)液，加入100 μl DMSO，37℃10 min，492 nm處測(cè)定吸光度。

1.5 劃痕法檢測(cè)細(xì)胞的遷移能力

將兩種穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后的HUVEC分別接種至96孔培養(yǎng)板，待細(xì)胞密度長(zhǎng)至100%，用100 μl微量移液槍頭對(duì)兩組細(xì)胞進(jìn)行劃痕，PBS沖洗細(xì)胞2次，分別加入無(wú)血清培養(yǎng)基，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16 h，對(duì)兩組細(xì)胞劃痕進(jìn)行照相，取10個(gè)培養(yǎng)孔計(jì)算遷移到劃痕內(nèi)的細(xì)胞數(shù)。

1.6 Matrigel法檢測(cè)細(xì)胞的成管能力

將Matrigel膠置于4℃冰箱中2 h，使其完全溶解，向預(yù)冷的96孔板中加入Matrigel膠，每孔80 μl，37℃放置1 h成膠，將兩種穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后的HUVEC分別消化成細(xì)胞懸液，接種于已鋪好膠的96孔板中，每孔100 μl，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h后進(jìn)行照相，取6個(gè)培養(yǎng)孔觀察并計(jì)算血管腔的數(shù)目。

1.7 Western blot檢測(cè)

將兩種穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后的HUVEC分別接種至60 mm培養(yǎng)皿，待細(xì)胞密度長(zhǎng)至80%，提取各組細(xì)胞總蛋白，取各組細(xì)胞裂解液 20 μl，經(jīng) 8%SDS-PAGE后，轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，封閉1 h。一抗4℃孵育過夜，耦聯(lián)有辣根過氧化物酶的二抗室溫反應(yīng)1 h，采用ECL顯色方法進(jìn)行顯色。用Image J圖像分析系統(tǒng)對(duì)Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行掃描分析。

1.8 明膠酶譜分析

用含0.1%明膠的8%SDS-PAGE檢測(cè)基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-2和MMP-9活性。取各組細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)48 h的培養(yǎng)液20 μl，120V恒壓電泳2.0～2.5 h，凝膠經(jīng)2.5%TritonX-100漂洗3次后，加入反應(yīng)緩沖液(pH7.6，50 mmol/L Tris-HCl，10 mmol/L CaCl2，50 mmol/L NaCl，0.05%Brij35)，37℃ 孵 育 17 h，0.5%考馬斯亮藍(lán)染色1.5～2.0 h，脫色液(10%乙酸-40%甲醇)脫色至藍(lán)色背景下白色條帶清晰可見。用Image J圖像分析系統(tǒng)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行掃描分析。

1.9 細(xì)胞免疫熒光法觀察細(xì)胞微絲骨架(F-actin)的變化

利用鬼筆環(huán)肽熒光探針(FITC-Phalloidin)對(duì)微絲作直接熒光染色。具體步驟如下:將兩種穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后的HUVEC分別接種至玻璃底培養(yǎng)皿，培養(yǎng)至密度達(dá)50%，PBS洗細(xì)胞3次;4%中性多聚甲醛室溫固定15 min，PBS洗3次;0.1%TritonX-100處理細(xì)胞5 min，PBS洗3次;滴加1∶200稀釋的 FITCPhalloidin，于濕盒中室溫避光30 min，PBS洗3次;將染色后的細(xì)胞玻片置于激光掃描共聚焦顯微鏡(Eclipse TE2000-U，Nikon，Tokyo，日本)下觀察。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 11.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料用表示，所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，各樣本首先進(jìn)行方差齊性分析，生長(zhǎng)曲線測(cè)定結(jié)果用重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)t檢驗(yàn)進(jìn)行分析，其他實(shí)驗(yàn)均再采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HUVEC內(nèi)源性EBP50的表達(dá)

應(yīng)用RT-PCR方法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，HUVEC的RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA后，可以從中擴(kuò)增出EBP50片段，如圖1所示，HUVEC細(xì)胞中有內(nèi)源性EBP50的表達(dá)。

2.2 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系的鑒定

為獲得穩(wěn)定過量表達(dá)外源性EBP50的陽(yáng)性克隆，應(yīng)用Western blot方法檢測(cè)轉(zhuǎn)染了pBK-CMVHA-EBP50及pBK-CMV-HA的HUVEC的兩組細(xì)胞內(nèi)目的蛋白的含量，如圖2所示，應(yīng)用HA抗體檢測(cè)顯示，轉(zhuǎn)染了空白載體pBK-CMV-HA的HUVEC內(nèi)未檢測(cè)到外源性融合蛋白的表達(dá)，而轉(zhuǎn)染了pBKCMV-HA-EBP50的HUVEC內(nèi)在相對(duì)分子量50000處可見外源性融合蛋白的表達(dá)。

圖2 穩(wěn)定表達(dá)EBP50的HUVEC的鑒定

2.3 EBP50對(duì)HUVEC增殖的影響

采用MTT法檢測(cè)HA-HUVEC及EBP50-HUVEC的增殖能力，見圖3。

圖3 EBP50對(duì)HUVEC增殖能力的影響

2.4 EBP50對(duì)HUVEC遷移能力的影響

采用劃痕法檢測(cè)HA-HUVEC及EBP50-HUVEC的遷移能力，見圖4，與 HA-HUVEC相比，EBP50-HUVEC的遷移能力明顯下降約20%(t=2.89，P＜0.01)。

2.5 EBP50對(duì)HUVEC成管能力的影響

采用 Matrigel法檢測(cè) HA-HUVEC及 EBP50-HUVEC的成管能力，見圖5。

圖4 EBP50對(duì)HUVEC遷移能力的影響

圖5 EBP50對(duì)HUVEC成管能力的影響

2.6 EBP50表達(dá)對(duì)HUVEC Akt1磷酸化水平的影響

采用Westernblot法檢測(cè)HA-HUVEC及EBP50-HUVEC的 Akt1的磷酸化水平，見圖6，與HA-HUVEC相比，EBP50-HUVEC Akt1的磷酸化的水平明顯下降約40%(t=2.98，P＜0.01)。

圖6 EBP50表達(dá)降低HUVEC內(nèi)Akt1的磷酸化水平

2.7 EBP50表達(dá)對(duì)HUVEC分泌的明膠酶活性的影響

采用明膠酶譜法檢測(cè)HA-HUVEC及EBP50-HUVEC內(nèi)的明膠酶的活性，如圖7，與HA-HUVEC相比，EBP50-HUVEC內(nèi)MMP2的活性下降約50%(t=4.75，P＜0.01)，而MMP-9的活性無(wú)明顯改變。

與HA-HUVEC相比，EBP50-HUVEC內(nèi) MMP2的活性下降約50%(t=4.75，P＜0.01)，而MMP-9的活性無(wú)明顯改變。

2.8 EBP50表達(dá)對(duì)細(xì)胞微絲骨架分布影響的研究

采用免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)HA-HUVEC及EBP50-HUVEC內(nèi)微絲骨架的分布，見圖8。

圖7 EBP50表達(dá)對(duì)HUVEC分泌的明膠酶活性的影響

圖8 EBP50表達(dá)對(duì)HUVEC微絲骨架分布的影響

3 討論

EBP50是一個(gè)包含358個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，在組織中分布廣泛。由氨基端兩個(gè)串聯(lián)PDZ結(jié)構(gòu)域(PDZ-1和PDZ-2)和羧基端的ERM結(jié)構(gòu)域構(gòu)成。EBP50能夠結(jié)合30余種蛋白質(zhì)，包括脾源性酪氨酸激酶(spleen tyrosine kinase，SYK)［5］、磷酸酶與張力蛋白同源物(phosphataseandtensinhomolog，PTEN)［6］、血 小 板 衍 生 生 長(zhǎng) 因 子 受 體 (plateletderived growth factor receptors，PDGFR)［6-8］、磷脂酶Cβ(phospholipase Cβ，PLCβ)、β-環(huán) 連 蛋 白 (βcatenin)和ERM家族蛋白［9-10］等，調(diào)節(jié)和整合多種信號(hào)通路。近年來對(duì)于EBP50的研究集中在其抑癌能力，該能力可能是通過與多種抑癌蛋白(如磷酸化腫瘤抑制基因、膜突蛋白及酪氨酸激酶等)的相互作用及增強(qiáng)抑癌蛋白的穩(wěn)定性并與致癌蛋白結(jié)合而對(duì)其致癌功能進(jìn)行抑制而實(shí)現(xiàn)的［5，9-12］。Simoncini等［13］曾在HUVEC內(nèi)檢測(cè)到EBP50的表達(dá)并推測(cè)其可能在血管的發(fā)生過程中起一定作用。Song等［14］研究發(fā)現(xiàn)，EBP50僅在正常的血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，而在血管平滑肌細(xì)胞內(nèi)幾乎不表達(dá)，但在損傷后，EBP50在血管平滑肌細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)明顯增高，特別是在血管成形的過程中，EBP50在形成新的血管內(nèi)膜的細(xì)胞中表達(dá)明顯增高。這些研究均提示EBP50可能在血管的發(fā)生發(fā)展過程中起著重要的作用。我們的前期研究結(jié)果顯示，EBP50是在血管新生過程中表達(dá)顯著上調(diào)的基因之一［4］，在本研究中發(fā)現(xiàn)，EBP50能顯著抑制HUVEC的增殖、遷移和成管能力。

磷脂酰肌醇 3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)信號(hào)參與增殖、分化、凋亡和葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)等多種細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)。近年來發(fā)現(xiàn)，IA型PI3K和其下游分子蛋白激酶B(PKB或Akt1)所組成的信號(hào)通路與人類腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。該通路調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的增殖和存活，其活性異常不僅能導(dǎo)致細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化，而且與腫瘤細(xì)胞的遷移、黏附、腫瘤血管生成以及細(xì)胞外基質(zhì)的降解等相關(guān)，目前以PI3K-Akt1信號(hào)通路關(guān)鍵分子為靶點(diǎn)的腫瘤治療策略正在發(fā)展中?，F(xiàn)有研究表明，在一些腫瘤細(xì)胞中，EBP50對(duì)Akt1信號(hào)通路起負(fù)性調(diào)控作用。Cardone等［15］研究表明，EBP50通過它的兩個(gè) PDZ結(jié)構(gòu)域調(diào)節(jié)細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力和親器官性。

MMP家族與細(xì)胞遷移和增殖密切相關(guān)。明膠酶是MMP家族成員之一，包括MMP-2和MMP-9，兩者均以酶原形式分泌，相對(duì)分子量分別為72000和92(或95000)，活化后前者相對(duì)分子量為68000、66000或62000，后者相對(duì)分子量為88000或85000。明膠酶的底物包括明膠、Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅹ型膠原和纖連蛋白。在體內(nèi)明膠酶可降解基底膜的主要結(jié)構(gòu)成分之一Ⅳ型膠原，對(duì)腫瘤細(xì)胞穿過細(xì)胞外基質(zhì)及轉(zhuǎn)移至關(guān)重要，因而該酶與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。

細(xì)胞骨架是細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)組成的網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)，包括微管、微絲和中等纖維。微絲是調(diào)節(jié)細(xì)胞貼壁、伸展和形態(tài)的主要結(jié)構(gòu)，在細(xì)胞行使多種功能如增殖時(shí)發(fā)揮重要作用，也是細(xì)胞骨架中與凋亡信號(hào)分子關(guān)系最密切的成員。細(xì)胞分化和運(yùn)動(dòng)時(shí)微絲骨架會(huì)發(fā)生重組，微絲骨架可能起著介導(dǎo)胞外信號(hào)分子的作用［5，7-8］。Phalloidin 能夠特異性結(jié)合微絲骨架應(yīng)力纖維主要成分F肌動(dòng)蛋白，因而采用激光掃描共聚焦顯微鏡可以很好地觀察細(xì)胞中F肌動(dòng)蛋白的動(dòng)態(tài)變化。Sun等［16］研究表明，cdc2/cyclin B能夠調(diào)節(jié)EBP50的磷酸化水平，進(jìn)而通過影響細(xì)胞骨架重組調(diào)節(jié)細(xì)胞的黏附和形態(tài)的改變。

綜上所述，EBP50可抑制HUVEC的增殖和遷移，此作用可能與其調(diào)整Akt1的磷酸化水平、調(diào)節(jié)細(xì)胞分泌明膠酶的活性及影響微絲細(xì)胞骨架分布有關(guān)。

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