朱珠 張萌 王斌

免疫球蛋白(immunoglobulin，Ig)是經(jīng)典的免疫分子，其主要行使免疫防御功能，這是過去半個(gè)多世紀(jì)免疫學(xué)最經(jīng)典的理論之一。近年來，越來越多的研究表明，很多非B細(xì)胞也可以產(chǎn)生Ig［1-10］。2009年，Jawahar在小鼠心肌組織和HL-1小鼠心肌細(xì)胞系中檢測到Ig的表達(dá)，并發(fā)現(xiàn)其表達(dá)水平與心肌缺血損傷有密切關(guān)系，即在血管緊張素Ⅱ灌注時(shí)，Ig重鏈和輕鏈的轉(zhuǎn)錄本表達(dá)下調(diào)。此外，近年來已有一些報(bào)道顯示，心肌梗死時(shí)心肌細(xì)胞間質(zhì)中有大量IgM沉積［11-12］，并且血液中 IgM 及 Ig輕鏈(包括 λ和κ輕鏈)的表達(dá)水平也發(fā)生改變。心肌纖維化是指心肌組織結(jié)構(gòu)中膠原纖維過量積聚，膠原濃度和膠原容積分?jǐn)?shù)顯著增加，各型膠原比例失衡及排列紊亂，具有收縮功能的心肌細(xì)胞數(shù)量減少，心室發(fā)生重構(gòu)，室壁增厚，心肌順應(yīng)性降低，心肌收縮舒張障礙［13］。目前，心肌纖維化病理損傷機(jī)制尚不完全明確。

在本研究中我們用抗小鼠IgM重鏈抗體及κ輕鏈抗體對正常小鼠及小鼠心肌纖維化模型中的心肌組織進(jìn)行免疫組織化學(xué)檢測，探討Ig分子是否在心肌細(xì)胞中存在及其定位;在心肌組織纖維化時(shí)，心肌細(xì)胞Ig分子表達(dá)水平及其定位的變化，由此可提示Ig分子在正常及病理?xiàng)l件下存在于心肌細(xì)胞中的意義。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

雄性野生型C57BL/10小鼠12只(購自維通利華)，體質(zhì)量26～33 g，8～10周齡，分成3組，每組各4只。正常組:不處理;AngⅡ組:背部皮下手術(shù)植入AngⅡ微量泵;對照組:植入微量泵泵入生理鹽水。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑和儀器

兔抗鼠IgM抗體(Bioss，USA)，生物素標(biāo)記的羊抗鼠IgM抗體(Vector Laboratories)，HRP標(biāo)記的山羊抗兔抗體(JacksonImmunoResearch Laboratories)，兔抗鼠Igκ抗體(委托天津三箭公司生產(chǎn))，DAB 顯色系統(tǒng)(Dako Cytomation)，Alexa Fluor 800標(biāo)記的鏈霉卵白素(LI-COR Bioscience)，AngⅡ(Sigma-Aldrich)，Alzet植入式膠囊滲透壓微量泵(DURECT)。

1.3 小鼠心肌纖維化模型制備

術(shù)前1 d于超凈臺內(nèi)取出微量泵，浸泡于生理鹽水中，37℃過夜，根據(jù)實(shí)驗(yàn)小鼠體質(zhì)量、藥物灌注速率、微量泵釋放速率和最大容積，計(jì)算AngⅡ和所需0.01%乙酸溶液用量。手術(shù)當(dāng)天，于超凈臺中用1%戊巴比妥溶液按照20 mg/kg腹腔注射麻醉，小鼠肩背部皮膚備皮，75%酒精棉球消毒，剪開皮膚于皮下造囊，埋入預(yù)置微量泵，縫合［14］。假手術(shù)組小鼠泵入生理鹽水，實(shí)驗(yàn)組小鼠泵入 AngⅡ(1500 ng·kg－1·min－1)。術(shù)后小鼠血壓升高，為造模成功。

1.4 觀察指標(biāo)

開胸取出心臟，PBS中洗凈血液，置于甲醛中。將各組小鼠的心臟組織制成5 μm厚度的石蠟切片。進(jìn)行HE染色，經(jīng)脫蠟水化后，蘇木素染色，分色，返藍(lán)，伊紅染色，脫水，二甲苯透明，樹膠封片。

免疫組織化學(xué)染色小鼠心肌石蠟切片，經(jīng)脫蠟、水化、抗原修復(fù)后，加入10%的羊血清室溫封閉20 min，分別加入不同一抗(兔抗鼠IgM、兔抗鼠Igκ特異性抗體)，37℃孵育1 h，并用PBS代替一抗作為對照。用PBS沖洗3次，每次5 min。每張切片滴加不同二抗，37℃孵育30 min，PBS沖洗3次后用DAB顯色，蘇木素復(fù)染后樹膠封片。顯微鏡下觀察。

Western Blot檢測Ig分子腹腔注射水合氯醛麻醉小鼠，體外用PBS灌流除去血液后，剪下心臟，加入RIPA裂解液，勻漿，冰浴30 min，12000×g離心15 min，取上清，定量，以小鼠血清作為陽性對照，取100 μg蛋白經(jīng) 10%SDS-PAGE電泳后，電轉(zhuǎn)至PVDF膜上，5%牛奶封閉1 h，加入生物素標(biāo)記的羊抗鼠 IgM(1∶1000 稀釋)，4℃過夜，TBST 洗膜后，加入1∶10000 Alexa Fluor 800標(biāo)記的鏈霉卵白素，室溫1 h，TBST洗膜后用Odssey Imaging System檢測Ig的表達(dá)。

2 結(jié)果

2.1 IgM在正常小鼠心肌組織中的定位

抗IgM染色結(jié)果顯示，正常心肌的心肌細(xì)胞呈現(xiàn)較強(qiáng)的陽性染色，陽性信號主要位于心肌細(xì)胞的橫紋及閏盤。同樣，抗Igκ染色也顯示，Igκ主要位于橫紋，尤其是靠近細(xì)胞膜的一側(cè)染色增強(qiáng)，并呈節(jié)段性分布(圖1)。

圖1 正常心肌組織中IgM的染色情況。A、B.正常心肌組織抗IgM重鏈抗體的染色情況;C.為心肌組織中抗κ輕鏈抗體的染色情況;D.二抗對照，黑色箭頭所示為心肌閏盤，紅色箭頭所示為心肌橫紋(×400)

2.2 心肌組織中IgM的表達(dá)情況

為了排除血液中Ig的污染，我們首先應(yīng)用體外灌流的方法除去心臟中的血液成分。提取心肌組織蛋白后，用IgM重鏈抗體進(jìn)行Western Blot檢測。結(jié)果顯示，在還原電泳條件下，可在75000左右的位置上出現(xiàn)特異性的陽性條帶，證實(shí)心肌組織中IgM重鏈的存在(圖2)。

圖2 Western Blot檢測IgM在小鼠心肌組織中的表達(dá)。血清為陽性對照。檢測了3只不同小鼠(1，2，3)的心肌組織。IgM陽性條帶位于相對分子量75000處，GAPDH位于34000處

2.3 心肌纖維化組織中IgM的表達(dá)情況

2.3.1 HE染色明確實(shí)驗(yàn)組心肌組織發(fā)生纖維化鏡下觀察可見，假手術(shù)組心肌排列規(guī)律，肌纖維排列緊密。而AngⅡ埋泵組心肌細(xì)胞彌漫性空泡變，心肌細(xì)胞肥大，核固縮，可見多灶性的陳舊性心肌梗死灶或瘢痕灶。說明造模成功(圖3)。

圖3 假手術(shù)組和心肌纖維化組HE染色情況。左圖為假手術(shù)組心肌HE染色情況。右圖為血管緊張素Ⅱ埋泵組心肌染色情況，可見心肌細(xì)胞空泡變，心肌細(xì)胞肥大，核固縮，心肌間質(zhì)廣泛纖維化(×400)

2.3.2 心肌纖維化時(shí)IgM在心肌細(xì)胞中表達(dá)水平升高 免疫組織化學(xué)染色發(fā)現(xiàn)，盡管實(shí)驗(yàn)組及對照組小鼠的心肌細(xì)胞都呈現(xiàn)陽性染色，但實(shí)驗(yàn)組正常區(qū)域的心肌細(xì)胞呈現(xiàn)更強(qiáng)的染色，而在纖維化區(qū)域組織則未見染色或呈現(xiàn)弱陽性染色(圖4)。

圖4 IgM在假手術(shù)組和心肌纖維化組小鼠心肌中的染色情況。A.假手術(shù)組心肌組織的染色情況;B.心肌纖維化組心肌組織的染色情況(未顯示纖維化區(qū)域);C.纖維化區(qū)域心肌組織的染色情況(箭頭所示纖維化區(qū)域，×400)

3 討論

自從非B細(xì)胞來源Ig發(fā)現(xiàn)以來，越來越多的科學(xué)家在不同來源的組織中檢測到Ig的表達(dá)。本研究在前期工作的基礎(chǔ)上，第1次明確了IgM分子可以在正常小鼠和纖維化心肌組織中表達(dá)。

眾所周知，B細(xì)胞表達(dá)的Ig主要以膜型及可溶型的形式存在，其中膜型的Ig通過識別特異性抗原介導(dǎo)B細(xì)胞的活化，而可溶型的Ig是B細(xì)胞分化為漿細(xì)胞的產(chǎn)物，是B細(xì)胞來源Ig的主要存在形式及效應(yīng)分子，作為抗體行使體液免疫應(yīng)答。非B細(xì)胞來源的Ig也可呈現(xiàn)膜型及可溶型的形式，但眾多的研究表明，其主要定位于細(xì)胞質(zhì)［15-16］。盡管到目前為止，非B細(xì)胞來源Ig的功能還不完全清楚，但越來越多的證據(jù)表明，其主要涉及細(xì)胞的增殖、遷移及生存，甚至腫瘤的發(fā)生［17］，而不是抗體功能。提示非B細(xì)胞來源Ig是不同于經(jīng)典的、新發(fā)現(xiàn)的另一類Ig分子。

心肌纖維化是由于成纖維細(xì)胞大量增殖，以膠原蛋白為主的多種細(xì)胞外基質(zhì)沉積在心肌細(xì)胞間質(zhì)，導(dǎo)致心肌組織重構(gòu)進(jìn)而造成心臟舒縮功能障礙的病癥。在本研究中，我們用外源給予AngⅡ的策略制備了小鼠心肌纖維化模型，并進(jìn)一步探討了Ig分子在心肌組織發(fā)生纖維化后其表達(dá)水平及細(xì)胞定位的變化。我們的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在病變心肌組織，特別是在橫紋呈現(xiàn)更強(qiáng)的IgM及Igκ染色。提示心肌纖維化促進(jìn)了心肌細(xì)胞表達(dá)IgM，但I(xiàn)gM的表達(dá)是否參與心肌纖維化的發(fā)病有待于進(jìn)一步探討。

至于為何心肌纖維化時(shí)心肌細(xì)胞高水平表達(dá)IgM分子，我們有兩種猜測:其一，由心肌持續(xù)的缺血缺氧所誘導(dǎo)［12］;其二，由成纖維細(xì)胞誘導(dǎo)。因?yàn)槌衫w維細(xì)胞對心肌細(xì)胞的生長及生存具有明顯的促進(jìn)作用［18］，而在心肌纖維化時(shí)，成纖維細(xì)胞能分泌一些細(xì)胞因子如TGF-β等［19］，可能通過旁分泌等機(jī)制促進(jìn)了心肌細(xì)胞表達(dá)IgM分子。

綜上所述，本研究第1次發(fā)現(xiàn)了IgM在心肌細(xì)胞中的定位;在心肌組織發(fā)生纖維化時(shí)，IgM表達(dá)水平會明顯升高，但該IgM分子是否參與心肌纖維化亟待探討。

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