呼海娟 陳會強 劉靜 韓梅 崔煒

研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病患者的細胞鈣化程度高于正常人［1-2］，但具體機制還不清楚。而堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)是成骨細胞分化和功能成熟的早期的標志［2］，骨形態(tài)生成蛋白2(bone morphogeneticprotein2，BMP2)、BMP4(bone morphogenetic protein 4)能夠調(diào)節(jié)相關(guān)細胞發(fā)生成骨樣分化［3］。通過檢測這幾個相關(guān)指標可以反映細胞的骨化水平。因此，本實驗通過檢測上述指標探討高糖在瓣膜鈣化過程中是否發(fā)揮作用及其可能機制，旨在為鈣化性心臟瓣膜病的發(fā)病機理提供實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 動物 健康成年雄性SD大鼠(清潔Ⅱ級)，體重250～280 g，由河北省實驗動物中心提供，實驗動物質(zhì)量合格證明書編號:1402039。

1.1.2 主要試劑 DMEM高糖培養(yǎng)基(糖濃度25 mmol/L)、DMEM低糖培養(yǎng)基(糖濃度5.6 mmol/L)、甘露醇、胎牛血清、0.25%胰酶為Gibco產(chǎn)品;實驗所用抗體購自Santa Cruz，epitomic公司;其他試劑盒均購自北京中杉公司。

1.2 方法

1.2.1 主動脈瓣間質(zhì)細胞(aortic valve interstitial cell，AVIC)分離及培養(yǎng) 選取6～8只SD大鼠，經(jīng)麻醉后固定于手術(shù)臺上。75%酒精消毒胸腹部區(qū)域，之后迅速取出心臟，放入4℃預(yù)冷 PBS中，再移至超凈臺中充分漂洗。剔除心尖，沿左心室流出道將其剖開，充分暴露主動脈瓣。眼科鑷刮拭主動脈瓣心室面，用顯微鑷、顯微剪留取主動脈瓣，放入PBS中漂洗，之后將主動脈瓣鋪于培養(yǎng)皿中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。5～10 min后加入1 ml 10%DMEM高糖培養(yǎng)基。之后根據(jù)細胞生長情況，2～3 d換液一次。細胞在含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基中生長至匯合后，0.25%胰蛋白酶消化傳代，取4～6代細胞進行實驗。待細胞生長至匯合80%～90%后換用無血清培養(yǎng)液饑餓培養(yǎng)24 h，使細胞同步于靜止期，之后再恢復10%DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)不同時間，收集細胞用于實驗。

1.2.2 免疫熒光染色鑒定 將處于對數(shù)生長期的AVIC接種于載玻片上，培養(yǎng)至50% ～60%密度后，用4%多聚甲醛固定細胞10 min，PBS漂洗，0.25%Triton X-100室溫處理10 min，山羊血清室溫封閉30 min，棄掉封閉液。分別加入相應(yīng)的一抗二抗，最后用熒光顯微鏡觀察并記錄。

1.2.3 實驗分組及鈣化的誘導 呈對數(shù)期生長的瓣膜間質(zhì)細胞，待密度達到80% ～90%時，給予撤血清24 h，之后恢復10%血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)，并開始計時。實驗分為 10%DMEM 低糖組(5.6 mmol/L)，10%DMEM 高糖組(25 mmol/L)，及10%DMEM低糖加甘露醇組(5.6 mmol/L+19.4 mmol/L)(所加甘露醇用以使該組滲透壓與高糖組相同)。分別培養(yǎng)0、7和14 d，之后收集3個時間點的細胞用于測定其鈣化程度。

1.2.4 Von-kossa染色測定鈣化 收集上述3組細胞，棄培養(yǎng)皿內(nèi)上清液，PBS洗5 min，4%多聚甲醛室溫固定20 min，PBS洗5 min，清洗3次;1 ml/孔5% 硝酸銀溶液紫外照射1 h，棄殘液，PBS洗5 min，清洗3次;1 ml/孔5%硫代硫酸鈉溶液室溫5 min，棄殘夜，PBS洗5 min，顯微鏡下觀察拍照，黑色或棕色為陽性。

1.2.5 Western blot分析 取10%DMEM高糖(25 mmol/L)培養(yǎng)0、24、48和72 h的等量蛋白的提取液上樣，進行SDS-PAGE。電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。隨后與一抗ALP、BMP2、BMP4及相應(yīng)的二抗反應(yīng)，用化學發(fā)光法檢測抗原抗體結(jié)合區(qū)帶。用數(shù)碼成像分析系統(tǒng)軟件對結(jié)果進行定量分析。

1.2.6 Real-time PCR分析 提取10%DMEM高糖(25 mmol/L)培養(yǎng)0、12、24、48 和72 h 的 RNA，將其反轉(zhuǎn)錄成cDNA，根據(jù)RT-PCR實驗說明書進行加樣操作，用AB7300儀器進行定量分析。

1.3 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 主動脈瓣膜間質(zhì)細胞鑒定

該細胞顯微鏡下胞體呈多邊形、三角形或不規(guī)則形，可見多個分裂狀。免疫熒光染色分析結(jié)果表明，該細胞表達α-SMA和波形蛋白vimentin，為主動脈瓣膜間質(zhì)細胞，見圖1。

圖1 主動脈瓣膜間質(zhì)細胞熒光染色圖像(×100)

2.2 主動脈瓣膜間質(zhì)細胞鈣化測定

Von-kossa染色分析顯示，低糖組(5.6 mmol/L)和低糖加甘露醇組(5.6+19.4)mmol/L在3個時間點均沒有檢測到鈣化結(jié)節(jié)，表明在低糖濃度的作用下，隨著培養(yǎng)時間的延長，細胞沒有發(fā)生鈣化，見圖2。而在高糖組(25 mmol/L)，0 d時細胞經(jīng)染色后無著色點，為陰性;7d時細胞灶經(jīng)染色后為弱陽性，陽性面積較小，陽性細胞灶數(shù)量較少;14 d時細胞灶經(jīng)von-kossa染色后為強陽性，陽性面積較大，出現(xiàn)大量鈣化，見圖3。

2.3 主動脈瓣膜間質(zhì)細胞骨化相關(guān)因子蛋白水平檢測

為進一步分析瓣膜間質(zhì)細胞在高糖作用下發(fā)生骨化的早期分子學機制，本實驗收取高糖(25 mmol/L)培養(yǎng)0、24、48、72 h 的蛋白進行測定。Western blot結(jié)果顯示，主動脈瓣膜間質(zhì)細胞融合后繼續(xù)培養(yǎng)不同時間點，ALP的表達呈現(xiàn)逐漸增高的態(tài)勢，表明有向成骨細胞轉(zhuǎn)化的趨勢。BMP2及BMP4能夠誘導細胞發(fā)生成骨樣分化，因而對其進行檢測。結(jié)果表明，BMP2、BMP4在0及24 h幾乎沒有表達;48 h時BMP2、BMP4有少量表達;72 h時BMP2、BMP4表達較48 h相比明顯增加，差異具有統(tǒng)計學意義(均為P＜0.05)，見圖4。

2.4 主動脈瓣膜間質(zhì)細胞骨化相關(guān)因子轉(zhuǎn)錄水平測定

分別收取高糖(25 mmol/L)培養(yǎng) 0、12、24、48 h及72 h的RNA進行測定。Real-time PCR結(jié)果顯示，主動脈瓣膜間質(zhì)細胞融合后繼續(xù)培養(yǎng)不同時間時，ALP的轉(zhuǎn)錄水平呈現(xiàn)逐漸增高的態(tài)勢，表明有向成骨細胞轉(zhuǎn)化的趨勢。進而對部分BMP2，BMP4的轉(zhuǎn)錄水平進行檢測，在0 h時，BMP2、BMP4幾乎沒有表達;12、24 h時，BMP2、BMP4有少量表達;48、72 h時，BMP2、BMP4表達較24 h相比增加明顯(均為P＜0.05)，見圖5。相關(guān)引物序列見表1。

圖2 主動脈瓣膜間質(zhì)細胞在低糖條件下培養(yǎng)0、7、14 d的von-kossa染色(×100)

圖3 主動脈瓣膜間質(zhì)細胞在高糖條件下培養(yǎng)0、7、14 d的von-kossa染色(×100)

圖4 主動脈瓣膜間質(zhì)細胞骨化相關(guān)因子蛋白水平檢測

3 討論

圖5 主動脈瓣膜間質(zhì)細胞骨化相關(guān)因子轉(zhuǎn)錄水平檢測

表1 本實驗用到的實時定量PCR引物序列

隨著生活水平的不斷改善以及人口的老齡化，糖尿病的發(fā)病率逐年增高。糖尿病患者廣泛都存在血管鈣化，血管鈣化是糖尿病患者心血管疾病發(fā)病和死亡的主要獨立危險因素［4-5］。因此，本研究選擇糖濃度作為影響因素［6］，觀察其對于主動脈瓣膜間質(zhì)細胞鈣化是否發(fā)揮作用。本實驗分別用低糖、高糖及低糖加甘露醇培養(yǎng)瓣膜間質(zhì)細胞不同時間［6］，結(jié)果顯示，低糖組和低糖加甘露醇組均沒有鈣化結(jié)節(jié)出現(xiàn)，而在高糖組，細胞培養(yǎng)7和14 d后均出現(xiàn)了不同程度的鈣化結(jié)節(jié)，表明隨著高糖刺激時間的延長，主動脈瓣膜間質(zhì)細胞確實發(fā)生了鈣化。3組結(jié)果比較表明，鈣化形成主要為高糖所誘導，而滲透壓對鈣化的形成沒有影響。因此，對于糖尿病患者，積極控制飲食，降低血糖濃度，可能能夠延緩或者遏制瓣膜鈣化的形成。由于細胞鈣化是與骨化因子的表達有關(guān)，因此我們觀察了與鈣化相關(guān)的部分骨化因子的表達。結(jié)果顯示，高糖誘導的主動脈瓣膜間質(zhì)細胞的鈣化與骨化因子ALP、BMP2、BMP4表達增加有關(guān)。

在細胞鈣化早期，ALP的活性增強，ALP的作用主要是將有機磷酸化合物分解成無機磷酸鹽，使之與鈣離子結(jié)合形成羥磷灰石沉積于骨組織;同時能將焦磷酸鹽水解，使之失活，解除其對骨化的抑制作用。其表達和活性常被用作成骨細胞分化和功能成熟的早期的標志。因此，本研究中，我們對ALP基因水平和蛋白表達水平進行了研究，發(fā)現(xiàn)ALP活性隨著培養(yǎng)時間增加而增加，表明瓣膜間質(zhì)細胞在培養(yǎng)過程中逐漸轉(zhuǎn)化為成骨細胞表型。

骨形成蛋白屬于轉(zhuǎn)化生長因子TGF-β超家族成員。在病理情況下，主要通過旁分泌的方式調(diào)節(jié)相關(guān)細胞發(fā)生成骨細胞分化。本研究中，BMP2、BMP4蛋白表達水平及mRNA轉(zhuǎn)錄水平均隨培養(yǎng)時間延長而增加，在72 h時達峰值。有學者在CAS患者瓣葉檢測到BMPs，研究證實BMP2參與AVICs的鈣化過程［7-8］，可能與BMP2刺激后Cbfal和骨橋蛋白表達明顯增加有關(guān)［9］。

綜上所述，在高糖持續(xù)作用下，主動脈瓣膜間質(zhì)細胞培養(yǎng)一定時間后，骨化相關(guān)因子的表達增加，有向成骨細胞轉(zhuǎn)化的趨勢，為鈣化性心臟瓣膜病的預(yù)防和治療提供依據(jù)。本實驗不足之處在于僅在細胞培養(yǎng)過程中觀察到此現(xiàn)象，對其內(nèi)在的具體機制缺乏探索，下一步將就其內(nèi)在機制進行深入研究。

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