姜偉奇

(上海中醫(yī)藥大學(xué)科技中心病毒與免疫實驗室， 上海 201203)

蟾酥一詞源于《本草衍義》屬名貴中藥，為蟾蜍科動物中華大蟾蜍(Bufo bufo gargarizans Cantor)或黑眶蟾蜍(Bufo melanostictus Schneider)等的耳后腺及皮膚腺分泌的白色漿液，經(jīng)加工干燥制成。主要產(chǎn)于中國河北、山東、江蘇、浙江等地。本品性味甘辛、溫、有毒，近年研究證明，蟾酥不僅可以鎮(zhèn)痛、消炎、麻醉，還有抗癌、抗輻射、強心等多種生物活性[1，2]。由于蟾酥在臨床治療癌癥方面具有確切藥理活性，引起國內(nèi)外學(xué)者廣泛關(guān)注。本文將對蟾酥的化學(xué)成分和有關(guān)抗腫瘤作用加以綜述，旨在為蟾酥的開發(fā)利用提供參考。

1 蟾酥的化學(xué)成分

蟾酥的化學(xué)成分比較復(fù)雜，現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)蟾酥中主要含有多種強心甾體類化合物。通過對蟾酥的分離和鑒定，目前已確定其主要化學(xué)成分按結(jié)構(gòu)分類如下[3-5]：(1)強心甾體類化合物，可分為：蟾毒配基類(bufogenins，BGs)、脂蟾毒配基(resibufogenin，RBG)、華蟾毒配基(cinobufagin，CBG)、遠華蟾毒配基(telocinobufagin，TCBG)、蟾毒靈(bufalin，BL)、華蟾毒它靈(cinobufatalin)、日蟾毒它靈(gamabufotalinin)及南美蟾毒精等。(2)吲哚類生物堿及其衍生物，此類化合物含有吲哚環(huán)，是具有一定生物活性的水溶性吲哚生物堿，包含：蟾酥堿、蟾酥甲堿、5-羥色胺、去氫蟾酥堿等。(3)甾醇類，蟾酥含有膽甾醇、7α-羥基膽甾醇、7β-羥基膽甾醇、β-谷甾醇、麥角甾醇等。(4)其他類：近年來新發(fā)現(xiàn)的幾種成分，有20，21-環(huán)氧蟾毒內(nèi)酯、20S，21-環(huán)氧蟾毒配基、20R，21-環(huán)氧蟾毒配基、3-O-甲羧基-20S，21環(huán)氧蟾毒配基、3-O-20S，21-環(huán)氧蟾毒配基；蟾酥中尚含有腎上腺素及多種氨基酸。

目前研究表明，蟾酥及其活性成分具有抑制腫瘤細胞生長、誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡等作用。其中以有脂蟾毒配基、蟾毒靈和華蟾毒配基類化合物被認為是蟾酥抗腫瘤作用的主要活性成分。

2 蟾酥的抗腫瘤作用

近年來有研究報道，蟾酥及其制劑可抑制腫瘤細胞生長并能誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡，因而成為抗腫瘤藥物研發(fā)的熱點。蟾酥誘導(dǎo)細胞凋亡需要多種信號通路的調(diào)節(jié)，如線粒體途徑、死亡受體途徑、凋亡相關(guān)蛋白，如bcl-2，survivin，bax，p53基因和caspase蛋白等。其在蟾酥不同活性成分誘導(dǎo)的腫瘤細胞凋亡中發(fā)揮重要的作用。

2.1 蟾酥對白血病細胞的作用 Zhu等[6]研究表明蟾毒靈能以劑量時間依賴的方式抑制人急性早幼粒白血病NB4細胞增殖并誘導(dǎo)其發(fā)生凋亡，蟾毒靈協(xié)同MEK抑制劑PD98059作用于NB4細胞后能夠下調(diào)survivin的表達，并促進caspase-3的活化。說明蟾毒靈誘導(dǎo)NB4細胞凋亡過程中與survivin 基因表達下調(diào)有關(guān)。在蟾毒靈誘導(dǎo)的人白血病細胞株HL-60凋亡過程中，Bcl-2表達水平降低的同時發(fā)生了Bcl-2的裂解。HL-60細胞中存在磷酸化的Bcl-2，在蟾毒靈誘導(dǎo)細胞凋亡的過程中，Bcl-2表達下調(diào)的同時磷酸化水平降低，即發(fā)生脫磷酸化。蟾毒靈短時間處理后，蛋白激酶C(PKC)總活性沒有明顯變化，但PKCβⅡ發(fā)生快速膜轉(zhuǎn)位，隨后出現(xiàn)了Bcl-2的脫磷酸化。表明蟾毒靈導(dǎo)人類白血病HL-60細胞凋亡的機制可能與Bcl-2表達下調(diào)、裂解及脫磷酸化有關(guān)，并且PKCβⅡ發(fā)生的膜轉(zhuǎn)位活化可能參與了Bcl-2的脫磷酸化[7，8]。曲秀娟等[9]在研究SYK和Cbl家族蛋白在蟾毒靈誘導(dǎo)HL-60細胞凋亡過程中的作用機制發(fā)現(xiàn)蟾毒靈作用于HL-60細胞后，SYK蛋白快速被磷酸化，并以時間劑量依賴的方式下調(diào)Cbl和Cbl-b的表達，提示這可能也是蟾毒靈誘導(dǎo)細胞凋亡分子機制之一。劉云鵬等[10]在研究蟾毒靈誘導(dǎo)人白血病細胞株K562細胞分化和凋亡中發(fā)現(xiàn)，在細胞分化早期和細胞凋亡發(fā)生前，蟾毒靈明顯下調(diào)K562細胞WT1 mRNA和蛋白的表達，提示蟾毒靈誘導(dǎo)K562細胞向單核巨噬細胞分化和細胞凋亡可能與其對WT1的下調(diào)有關(guān)。盛秀勝等[11]還發(fā)現(xiàn)華蟾素能濃度依賴的抑制K562細胞生長，并通過流式細胞術(shù)分析發(fā)現(xiàn)華蟾素誘導(dǎo)K562細胞凋亡，其機制與提高Caspase-3表達有關(guān)。

2.2 蟾酥對乳腺癌細胞的作用 Yan等[12]利用MTT法檢測蟾毒靈對人腺癌細胞MCF-7和MDA-MB-231的細胞增殖活力，發(fā)現(xiàn)蟾毒靈對這2種細胞的增殖都有明顯的抑制作用并且呈時間劑量依賴。運用western blot，反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(yīng)(RT-PCR)等技術(shù)測定細胞中DR4和DR5基因mRNA的含量，從而判定細胞中DR4和DR5基因的表達水平，又利用caspase活性檢測和siRNA轉(zhuǎn)染技術(shù)檢測caspase-8的活化和PARP的裂解來進一步探討蟾毒靈與TARIL誘導(dǎo)細胞凋亡協(xié)同效應(yīng)的分子機制。實驗證明了在MCF-7和MDA-MB-231細胞中蟾毒靈能增強TARIL通過激活外源性凋亡途徑誘導(dǎo)的細胞凋亡并且蟾毒靈作用于細胞后與對照組相比DR4和DR5的表達顯著上調(diào)。同時研究證明蟾毒靈能上調(diào)DR4和DR5的表達是通過激活ERK、JNK和P38MAPK途徑并且下調(diào)Cbl-b實現(xiàn)的。Ma等[13]研究華蟾毒精誘導(dǎo)MDA-MB-231細胞凋亡的機制發(fā)現(xiàn)華蟾毒精能夠以劑量時間依賴的方式抑制MDA-MB-231細胞的增殖，當用50μg/ml的華蟾毒精作用于細胞48 h后，早期細胞凋亡率與對照組相比有顯著性差異，細胞周期阻滯在S期。利用原子力顯微鏡觀察到華蟾毒精能破壞細胞骨架改變細胞表面超微結(jié)構(gòu)和細胞形態(tài)。為進一步研究華蟾毒精誘導(dǎo)細胞凋亡的分子機制提供新的思路。

2.3 蟾酥對肺癌細胞的作用 肺癌是最常見的惡性腫瘤之一。非小細胞肺癌約占肺癌病例的80～85%，其中大部分患者被診斷時已經(jīng)是晚期[14]。有研究證實[15～16]在體外實驗條件下，采用不同濃度的蟾毒靈作用于A549細胞后，發(fā)現(xiàn)蟾毒靈能抑制細胞增殖，且呈劑量時間依賴。通過Western blot檢測相關(guān)蛋白的表達，結(jié)果顯示蟾毒靈可以抑制Akt的活化，蟾毒靈與Akt抑制劑聯(lián)合作用于A549細胞后能誘導(dǎo)其凋亡，并能上調(diào)Bax的表達，下調(diào)Bcl-2和livin的表達，進一步活化caspase-3。提示蟾毒靈誘導(dǎo)A549細胞凋亡是通過抑制PI3K/Akt途徑實現(xiàn)的。陳同生等[17]采用基因質(zhì)粒轉(zhuǎn)染技術(shù)、熒光發(fā)射譜檢測分析以及熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)受體光漂泊技術(shù)，首次在活細胞中實時檢測蟾酥誘導(dǎo)人肺腺癌(ASTC-a-1)細胞凋亡過程中caspase-3的活化特性。采用CCK-8技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)，蟾酥可以有效抑制ASTC-a-1細胞的增殖活性并具有劑量依賴性。用蟾酥處理穩(wěn)定表達FRET質(zhì)粒SCAT3的人肺腺癌ASTC-a-1細胞，采用熒光發(fā)射譜檢測分析以及熒光共振能量轉(zhuǎn)移受體光漂白技術(shù)，2h后明顯觀察到活化的caspase-3將SCAT3切割為兩部分，并且SCAT3的切割程度隨著蟾酥作用時間的延長而增加，24 h內(nèi)細胞內(nèi)的SCAT3完全被切割。表明caspase-3 參與調(diào)控了蟾酥誘導(dǎo)的細胞凋亡過程。Sun[18]等研究發(fā)現(xiàn)，當蟾毒靈作用于人肺腺癌ASTC-a-1 細胞時可以產(chǎn)生大量活性氧，同時增強caspase-3 活性，促使凋亡蛋白Bax 從細胞質(zhì)向線粒體移位，從而誘導(dǎo)ASTC-a-1 細胞凋亡。

2.4 蟾酥對肝癌細胞的作用 Qi等[19]發(fā)現(xiàn)蟾毒靈和華蟾毒精能顯著改變肝癌細胞株HepG2凋亡形態(tài)，使凋亡細胞數(shù)量顯著增加。其誘導(dǎo)細胞凋亡的途徑與上調(diào)Fas、Bax、Bid的表達，抑制Bcl-2蛋白表達，同時降低線粒體膜電位，釋放細胞色素C，活化Caspase-3，8，9，10有關(guān)。提示蟾毒靈和華蟾毒精誘導(dǎo)細胞凋亡的機制主要是通過Fas和線粒體途徑介導(dǎo)的。另有研究表明蟾毒靈作用于HepG2后可使細胞周期阻滯在G2/M期通過下調(diào)Aurora A、CDC25、CDK1、cyclin A并上調(diào)p53和p21蛋白的表達，同時降低線粒體膜電位使細胞內(nèi)Ca水平和活性氧的產(chǎn)生增加，活化caspase-9和caspase-3[20]。

肖義秀等[21]通過流式細胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)脂蟾毒配基能誘導(dǎo)人肝癌細胞Bel-7402發(fā)生凋亡，其凋亡率超過50%，呈劑量依賴。脂蟾毒配基作用于Bel-7402后，Bax蛋白表達增加，對細胞凋亡的產(chǎn)生具有促進作用，并與Bcl-2蛋白表達的下降有協(xié)同作用。黃應(yīng)申等[22]通過流式細胞術(shù)和Western Blot等實驗方法研究發(fā)現(xiàn)脂蟾毒配基還可引起線粒體跨膜電位下降，細胞色素C釋放增多，活化Caspase-3，同時抑制Bcl-2蛋白表達，誘導(dǎo)細胞凋亡。

2.5 蟾酥對胃癌細胞的作用 Li等[23]實驗結(jié)果顯示蟾毒靈能劑量和時間依賴性的抑制胃癌細胞株MGC803的增殖，在低濃度為20 nmol/l下蟾毒靈可誘導(dǎo)細胞周期阻滯在M期。在高濃度80 nmol/l下能誘導(dǎo)細胞凋亡。一方面可能與下調(diào)Bcl-2的表達，降低Bcl-2/Bax比值并活化caspase-3有關(guān)。另一方面，研究中還發(fā)現(xiàn)蟾毒靈能瞬時激活PI3K/Akt信號通路隨后再將其完全抑制，上調(diào)Cbl的表達，這些結(jié)果表明PI3K/Ak通路可能在蟾毒靈誘導(dǎo)胃癌MGC803細胞凋亡過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。孟書聰?shù)萚24]利用流式細胞術(shù)檢測細胞周期、細胞凋亡率及其線粒體膜電位變化；Western blot檢測與細胞凋亡相關(guān)基因蛋白表達的變化。實驗證明脂蟾毒配基能顯著抑制細胞生長，且呈劑量時間依賴。低劑量作用時間為24～48 h，將細胞阻滯在S期，處于G2/M期的細胞數(shù)量少，隨作用時間延長阻滯細胞在G2/M 期。脂蟾毒配基引起細胞線粒體膜電位下降，釋放到胞質(zhì)中的細胞色素C增多，促進caspase-3活化，抑制Bcl-2的表達，誘導(dǎo)細胞凋亡。進一步表明脂蟾毒配基可誘導(dǎo)人胃癌BGC-823細胞發(fā)生凋亡，其誘導(dǎo)凋亡作用機制與線粒體通路有關(guān)。

2.6 蟾酥對宮頸癌細胞 Cao等[25]研究發(fā)現(xiàn)當用10-8M的蟾毒靈作用于人宮頸癌Hela細胞時，細胞凋亡程度具有時間依賴性。而且細胞中Tiam1蛋白含量開始增加，在30 min后達到最大表達量，隨著時間的延長Tiam1蛋白表達水平逐漸下降。提示Taim1蛋白在蟾毒靈誘導(dǎo)的Hela細胞凋亡中發(fā)揮重要作用。王鸝等[26]采用MTT法和流式細胞術(shù)等實驗方法研究華蟾毒精抑制Hela細胞增殖作用機制，結(jié)果表明華蟾毒精對Hela細胞的增殖有顯著的抑制作用?？墒辜毎芷谧铚贕2/M期，并對Hela細胞內(nèi)相對分子質(zhì)量較小的酸性蛋白表達有明顯的影響。Emam等[27]研究結(jié)果顯示，華蟾毒它靈作用于Hela細胞后，線粒體膜電位下降，細胞內(nèi)鈣離子和活性氧的產(chǎn)生增加。此外，華蟾毒它靈能上調(diào)Fas、Bid、Bax的表達并活化細胞色素C和caspase-2，-3，-8，-9，提示華蟾毒它靈誘導(dǎo)Hela細胞凋亡主要是通過Fas和線粒體途徑介導(dǎo)的。

3 小結(jié)

蟾酥在中國的用藥歷史悠久，具有較強的藥理活性，受到研究者的廣泛關(guān)注。近年來的研究結(jié)果已經(jīng)證實蟾酥及其活性成分對于白血病、乳腺癌、肺癌、肝癌、胃癌等腫瘤細胞具有有效的抗癌活性。但蟾酥作為藥物使用可導(dǎo)致頭暈、惡心、抽搐甚至死亡[28]。這些毒副作用加大了臨床使用風(fēng)險，不適合長期連續(xù)服用。因此，要加強臨床前的實驗研究，確定臨床有效的用藥劑量，提高臨床用藥的安全性和有效性。蟾酥成分復(fù)雜，目前的研究表明，蟾酥不同活性成分發(fā)揮抗腫瘤作用具有多靶點的特征。因此，需充分利用現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)全面深入的闡明蟾酥活性成分抗腫瘤的作用機制，為研制出高效低毒的抗癌藥物提供理論依據(jù)。

參考文獻：

[1]董文波，昊補領(lǐng)，朱明慧.蟾酥制劑的臨床療效和作用特點[J].中華醫(yī)藥學(xué)雜志，2003，(10)：26-27.

[2]中國國家藥典委員會.中華人民共和國藥典[S].北京化工出版社，2010：265-266.

[3]謝麟，長青.蟾蜍產(chǎn)品的醫(yī)藥價值及其資源的開發(fā)利用[J].四川畜牧獸醫(yī)，2002，29(12)：32-34.

[4]Kamano Y，Nogawa T，Yamashita A，et al.Isolation and structure of a 20，21-epoxybufenolide series from”ChanSu”[J].Nat Prod，2002，65(7)：1001-1005.

[5]Bick RJ，Poindexter BJ，Sweney RR，et al.Effects of Chan Su，a tradition Chinese medicine，on the calcium transients of isolated cardiomycocytes：Cardiotoxicity due to more than Na，K-ATPase blocking[J].Life Sci，2002，72(6)：699-709.

[6]Zhu Z，Li E，Gao Y，et al.Bufalin Induces the Apoptosis of Acute Promyelocytic Leukemia Cells via the Downregulation of Survivin Expression[J].Acta Heamatol，2012，128(3)：144-150.

[7]田昕，王萍萍，劉云鵬.蟾蜍靈在誘導(dǎo)HL-60細胞凋亡過程中對Bcl-2和PKC的影響[J].中國實驗血液學(xué)雜志，2007，15(1)：67-71.

[8]Luo Y，Liu YP，Hou KZ，et al.Molecular mechanism of differentiation and apoptosis of U937 cells induced by 12-O-tetradecan olphorbol-13-acetate[J].Chin J C lin Oncol，2005，2：553-557.

[9]曲秀娟，趙明芳，劉云鵬.蟾毒靈在誘導(dǎo)HL-60細胞凋亡時對SYK和CBL家族蛋白的影響[J].中國實驗血液學(xué)雜志，2009，17(1)：65-68.

[10]劉云鵬，曲秀娟，王萍萍.蟾蜍靈誘導(dǎo)K562 細胞分和凋亡過程中WT1表達的下調(diào)[J].中華血液學(xué)雜志，2002，23(7)：356-359.

[11]盛秀勝，徐玲娟.華蟾素誘導(dǎo)人紅白血病細胞K562 凋亡及對Caspase-3表達的影響[J].實用腫瘤雜志，2007，22(1)：32-36.

[12]Yan S，Qu X，Xu，C，et al.Down-regulation of Cbl-b by bufalin results in up-regulation of DR4/DR5 and sensitization of TRAIL-induced apoptosisin breast cancer cells[J].Cancer Res Clin Oncol，2012，138：1279-1289.

[13]Ma L，Song B，Jin H，et al.Cinobufacini induced MDA-MB-231 cell apoptosis-associated cell cycle arrest and cytoskeleton function[J].Bioorganic&Medicinal Chemistry Letters，2012，22：1459-1463.

[14]Rivera MR.Multimodality therapy in the treatment of lung cancer[J].Semin Respir Crit Care Med，2004，25(1)：3-10.

[15]Zhu Z，Sun H，Ma G et al.Bufalin Induces Lung Cancer Cell Apoptosis via the Inhibition of PI3K/Akt Pathway[J].Molecular Scienes，2012，13：2025-2035.

[16]Jiang Y，Zhang Y，Luan J，et al.Effects of bufalin on the proliferation of human lung cancer cells and its molecular mechanisms of action[J].Cytotechnology，2010，62(6)：573-583.

[17]陳同生，王小平，孫磊.Caspase-3參與調(diào)控蟾酥誘導(dǎo)人肺腺癌(ASTC-a-1)細胞的凋亡[J].生物化學(xué)與生物物理進展，2008，35(1)：85-90.

[18]Sun L，Chen T，Wang X et al.Bufalin Induces Reactive Oxygen Species Dependent Bax Translocation and Apoptosis in ASTC-a-1 Cells[J].Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine，2011：249090.

[19]Qi F，Inagaki Y，Gao B et al.Bufalin and cinobufagin induce apoptosis of human hepatocellular carcinoma cells via Fas-and mitochondria-mediated pathways[J].Cancer Science，2011，102(5)：51-958.

[20]Zhang D，Liu J，Tang M et al.Bufotalin from Venenum Bufonis inhibits growth of multidrug resistant HepG2 cells through G2/M cell cycle arrest and apoptosis[J].European Journal of pharmacology，2012，692：19-28.

[21]肖義秀，張瑾蜂，吳白燕.脂蟾毒配基誘導(dǎo)人肝癌細胞凋亡作用的研究[J].中國生物工程雜志，2006，26(6)：36-39.

[22]黃應(yīng)申，肖軍軍，孟書聰.脂蟾毒配基通過線粒體途徑誘導(dǎo)人肝癌Bel-7402細胞凋亡的研究[J].中國腫瘤臨床，2006，33(20)：1141-1145.

[23]LiD，Qu X，Hou et al.PI3K/Akt is involved in bufalin-induced apoptosis in gastric cancer cells[J].Anticancer Drugs，2009，20(1)：64.

[24]孟書聰，董曉敏，肖軍軍.脂蟾毒配基對人胃癌BGC-823細胞系細胞生長的干預(yù)效應(yīng)[J].中國臨床康復(fù)，2006，10(43)：138-141.

[25]Cao H，Shibayama I，Masuda Y，et al.Involvement of Tiam1 in apoptosis induced by bufalin in HeLa cells[J].Anticancer Research，2007，27：245-250.

[26]王鸝，吳軍，李敏.華蟾毒精抑制HeLa細胞增殖作用機制的探討[J].中華腫瘤雜志，2005，27(12)：717-720.

[27]Emam H，Zhao Q，F(xiàn)urusawa Y，et al.Apoptotic cell death by the novel natural compound，cinobufotalin[J].Chem Bio Interact，2012，199(3)：154-160.

[28]Xie J，Wang H，Attele AS，et al.Effects of resibufogenin from toad venomon isolated Purkinje fibers[J].Am J Chin Med，2008，28(2)：187-196.