劉春景 白 榮 宋繼榮 董晶晶 王學(xué)涵 馬 艷

新疆醫(yī)科大學(xué)第五附屬醫(yī)院風(fēng)濕科(烏魯木齊830011)

△新疆醫(yī)科大學(xué)研究生院(830054)

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是以關(guān)節(jié)對稱性滑膜炎、骨侵蝕為特征自身免疫性疾病。其發(fā)病原因未明，抗原特異性T細(xì)胞的激活始終被認(rèn)為是RA發(fā)病起始和進(jìn)展的中心環(huán)節(jié)［1］。細(xì)胞、細(xì)胞是T細(xì)胞重要的亞群，尤其是細(xì)胞的亢進(jìn)可以通過分泌炎性細(xì)胞因子致病、細(xì)胞和抗原提呈細(xì)胞相互作用導(dǎo)致RA發(fā)病是近年的共識，并且認(rèn)為CD4+T細(xì)胞參與關(guān)節(jié)炎癥反應(yīng)的多個方面。有人認(rèn)為關(guān)節(jié)炎模型鼠外周血CD4+T異常增殖，導(dǎo)致細(xì)胞比例失衡，因此糾正失衡是RA治療藥物的治療機制之一［2］。蓬草除痹湯(PCCB)是由新疆地道中藥駱駝蓬草及獨活等十余味中藥組成的，具有補益肝腎，滋養(yǎng)氣血，散寒祛瘀通絡(luò)之功效，初步研究表明其具有抑制RA模型大鼠關(guān)節(jié)中核因子κB受體活化因子配體和血清細(xì)胞因子的作用［3］，為了進(jìn)一步探討PCCB治療RA的免疫調(diào)節(jié)作用機制，采用流式細(xì)胞技術(shù)，觀察其對CIA大鼠外周血CD4+T細(xì)胞、細(xì)胞及T表達(dá)的影響，現(xiàn)報道如下。

1 材 料1.1 實驗動物 Wistar大鼠由新疆維吾爾自治區(qū)動物研究疾病控制中心提供。選擇55只清潔級，雌雄各半，體重112.43 ±20.2g。

1.2 實驗藥品 中藥飲片購自新疆醫(yī)科大學(xué)第五附屬醫(yī)院藥劑科。PCCB組方:桑寄生、續(xù)斷、獨活、黃芪各15g，當(dāng)歸、補骨脂各12g，駱駝篷草、炒麥芽、甘草各9g等。上藥煎藥室加工，水煎抽濾除渣、水溶蒸發(fā)濃縮，濃度為含生藥1.95g/mL;雷公藤多甙片上海復(fù)旦復(fù)華藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，批號為:Z31020415，配制濃度為 0.575g/mL。

1.3 試劑 牛Ⅱ型膠原蛋白、弗氏不完全佐劑Sigma公司產(chǎn)品;冰醋酸為天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn);單克隆抗體CD3、CD8、CD4均為聯(lián)科生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品;溶血素為Beckman公司產(chǎn)品。

1.4 主要儀器 流式細(xì)胞儀，儀器型號:BD公司FACSCalibur。

2 方 法2.1 CIA大鼠模型制作及分組 實驗大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)2w后，隨機抽出10只作為空白組，其余45只復(fù)制膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎(CIA)模型，取牛Ⅱ型膠原蛋白和冰醋酸與弗氏佐劑混勻成乳液，在大鼠右足墊注射，按0.1mL/只的劑量。于第8d，再次在大鼠尾根部注射乳液，空白組在相同部位注射等量生理鹽水。按照AI＞5分為造模成功的標(biāo)準(zhǔn)，造模成功率為93.3%。將造模成功的42只大鼠隨機分為模型組、PCCB組、對照藥物雷公藤多甙組。

2.2 給藥方法及途徑 實驗各組均為灌胃給藥，PCCB組給予相當(dāng)于生藥19.5g/kg-1，雷公藤組給予雷公藤多甙片混懸液5.75g/kg;模型組和空白組給予生理鹽水，每日給藥1次，連續(xù)給藥28d。

2.3 取材 各組大鼠經(jīng)灌胃28d后，麻醉經(jīng)腹主動脈采血，用抗凝管保存。

2.4 CD4+T、CD8+T指標(biāo)檢測 抗凝血2h內(nèi)用流式細(xì)胞儀分析。

2.5 大鼠的AI測量 按大鼠多發(fā)性關(guān)節(jié)炎5級評分記錄法:0級:無紅腫:1級:小趾關(guān)節(jié)稍腫;2級:趾關(guān)節(jié)和趾跖腫脹;3級:踝關(guān)節(jié)以下的足爪腫脹;4級:包括踝關(guān)節(jié)在內(nèi)全部足爪腫脹進(jìn)行評分。每周評價1次。

2.6 統(tǒng)計方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理。實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，進(jìn)行多組間方差分析，以P ＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié) 果3.1 大鼠AI的變化 計算各大鼠AI的平均值與對照組比較、造模后7、14d各組大鼠的AI無明顯差異;治療4周后，PCCB組大鼠的AI較模型組顯著下降(P ＜0.01)。

表1 各組大鼠AI的變化(±s)

表1 各組大鼠AI的變化(±s)

注:與模型組比較:PCCB組與模型組比較●P ＜0.01，PCCB組與雷公藤組比較:◇P ＜0.05。

分組 動物(只)給藥0周 給藥1周 給藥2周 給藥3周 給藥4周.13 ±1.36 PCCB 組 10 8.11 ±0.93 8.11 ±1.67◇ 6.89 ±0.78 5.33 ±0.71 3.56 ±1.13●◇雷公藤組 10 8.00 ±0.12 8.22 ±0.83◇ 7.00 ±0.71 6.33 ±1.00 4.78 ±0.83模型組 10 8.0 ±0.76 9.13 ±0.84 10.88 ±1.46 9.63 ±1.41 8●

表2 蓬草除痹湯對CD4+T細(xì)胞、細(xì)胞及 的影響(±s)

表2 蓬草除痹湯對CD4+T細(xì)胞、細(xì)胞及 的影響(±s)

注:與空白組比較:◆P ＜0.01;與模型組比較:△P ＜0.05，▲P ＜0.01。

組 別 動物(只)CD4+T細(xì)胞 CD8+T細(xì)胞 CD4+T/CD8+T 10 43.66 ±8.67 15.52 ±2.81 2.86 ±0.55模型組 10 53.24±5.96● 10.86±1.11● 4.96±0.84●PCCB 組 10 45.60 ±6.79△ 14.07 ±3.26△ 3.37 ±0.67▲雷公藤組 10 45.45±5.90△ 16.71±4.34▲ 2.90±0.87空白組▲

4 討 論RA屬中醫(yī)“痹證”等范疇，先天稟賦不足，正氣虛損，風(fēng)寒濕熱邪氣侵襲，痹阻經(jīng)絡(luò)、肌肉、骨節(jié)，影響氣血運行為基本病因病機，痹癥日久多夾雜痰瘀互結(jié)，其重者內(nèi)舍于臟。虛實夾雜、肝腎虧虛、氣血不足為本病的特點。PCCB由十余味中草藥組成，其中駱駝蓬草具有主治風(fēng)濕、堅固筋骨、散寒除濕，治療骨刺疼痛等作用［4］，整方配伍具有祛寒化瘀、益肝補腎、滋養(yǎng)氣虛、健脾和胃之功效。

［1］李巧霞，叢 斌，單保恩.T細(xì)胞與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎［J］.國際免疫學(xué)雜志，2011，34(1):1-5.

［2］易劍峰，易少波，雷波.雙氫青蒿素對AA大鼠外周血T淋巴細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用［J］.中國實驗方劑學(xué)雜志，2012，18(18):203-205.

［3］劉春景，田新瑋，王學(xué)涵，等.蓬草除痹湯干預(yù)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎大鼠骨吸收骨重建及細(xì)胞因子的表達(dá)［J］.中國組織工程研究，2012，16(24):4499-4504.

［4］新疆人民出版社.新疆中草藥［M］.新疆人民出版社，1975:66.

［5］劉春芳，林 娜.雷公藤甲素對Ⅱ型膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎小鼠免疫功能的影響［J］.中國中醫(yī)藥信息雜志，2004，11(7):602-604.

［6］高志芬，陳曉玲.類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者CD4+T、CD8+T細(xì)胞及免疫球蛋白的檢測及分析［J］.國際檢驗醫(yī)學(xué)雜志，2008，29(11):1046-1047.

［7］肖 鎮(zhèn)，劉彩霞，王 勇，等.類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎病人外周血T細(xì)胞亞群的表達(dá)及意義［J］.內(nèi)蒙古醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2008，30(1):1-5.