姚 琳

(上海交通大學(xué)生物工程專業(yè) 工程碩士班級(jí)Z1208021，上海200240)

1 傳統(tǒng)檢測(cè)方法回顧

以往對(duì)染色體非整倍體疾病的產(chǎn)前檢測(cè)大多采用血清學(xué)篩查加胎兒染色體核型分析診斷的方法，前者的假陽(yáng)性率較高，約有5%－10%的孕婦將被篩查為高風(fēng)險(xiǎn)，這些數(shù)量眾多孕婦不得不接受后者的診斷，而胎兒染色體核型分析又需要進(jìn)行羊水穿刺等，這類侵入式診斷方式意味著約1% 的流產(chǎn)率［1］，于是非侵入性的產(chǎn)前檢測(cè)方式成為廣大孕婦和醫(yī)療工作者共同的追求。同時(shí)，血清學(xué)篩查方法極高的假陰性率又使得為數(shù)眾多的患兒出生，給病人、家屬和社會(huì)帶來(lái)負(fù)擔(dān)，于是尋求一種準(zhǔn)確率較高的篩查方法刻不容緩。

傳統(tǒng)檢測(cè)方法的準(zhǔn)確率如圖1 顯示。

圖1 唐氏綜合征傳統(tǒng)篩查方法的準(zhǔn)確率

2 無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前檢測(cè)技術(shù)方法原理

無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前檢測(cè)( Noninvasive prenatal testing，NIPT) 是以孕婦外周血(5 mL) 作為檢測(cè)樣本，通過(guò)不加區(qū)分的對(duì)其中的總游離DNA 進(jìn)行大規(guī)模平行測(cè)序，結(jié)合數(shù)學(xué)模型和數(shù)據(jù)分析，對(duì)胎兒染色體非整倍性疾病進(jìn)行檢測(cè)。該方法在唐氏綜合征、13－三體綜合征和18－三體綜合征的產(chǎn)前檢測(cè)方面，方法成熟，數(shù)據(jù)可靠。該方法可以在胎盤循環(huán)建立后的整個(gè)孕期進(jìn)行檢測(cè)［2］，本著早發(fā)現(xiàn)的原則，其最佳檢測(cè)時(shí)間為孕早、中期，如在孕晚期通過(guò)超聲等手段發(fā)現(xiàn)可疑病例，仍可使用該方法進(jìn)行檢測(cè)。

為了更好地解釋其原理及數(shù)據(jù)分析依據(jù)，以21號(hào)染色體為例作如下假設(shè):

如圖2 所示，假設(shè)每毫升母體外周血中的染色體中有1 000 份21 號(hào)染色體基因組當(dāng)量，母源性的染色體占900 份，胎源性的染色體占100 份。對(duì)于懷有正常胎兒的孕婦，胎源性的100 份中有200 份的單鏈片段可以通過(guò)比對(duì)定位于21 號(hào)染色體上，母源性的900 份中有1 800 份的單鏈片段可以通過(guò)比對(duì)定位于21 號(hào)染色體上，通過(guò)計(jì)數(shù)，共獲得2 000份21 號(hào)染色體單鏈片段。而對(duì)于懷有唐氏綜合征胎兒的孕婦，由于其來(lái)自胎兒的21 號(hào)染色體多出一條，則胎兒的100 份基因組當(dāng)量中含有300 份的單鏈片段可以通過(guò)比對(duì)定位于21 號(hào)染色體上，母親的900 份基因組當(dāng)量中含有1 800 份的單鏈片段可以通過(guò)比對(duì)定位于21 號(hào)染色體上，兩者相加，2 100 份的單鏈片段可以通過(guò)比對(duì)定位于21 號(hào)染色體上。即使考慮染色體片段化程度不同的偶發(fā)因素，在測(cè)序通量足夠大的情況下，可以得到比較確定的結(jié)果，即懷有21－三體胎兒的單鏈片段數(shù)要大于懷有正常胎兒的單鏈片段數(shù)，從而對(duì)疾病進(jìn)行檢測(cè)。

圖2 數(shù)據(jù)比較:21－三體胎兒與正常胎兒

3 無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前診斷的具體操作

具體操作方法為，首先從離心孕婦外周血后獲得的血漿中抽提DNA，收集總DNA 中符合一定長(zhǎng)度的DNA，通常為100－200 bp，因?yàn)檫@個(gè)長(zhǎng)度的總游離DNA 中，胎兒游離DNA 的含量高，有利于后續(xù)檢測(cè)。然后使用T4 DNA 聚合酶( T4 DNA Polymerase)、克列諾片段( Klenow Fragment)、T4 多聚核苷酸激酶(T4 PNK)補(bǔ)平片段末端。在片段3’端加堿基A，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)的原則，使其與帶有T 堿基的接頭(Adaptor)連接，該接頭上還連有大規(guī)模平行測(cè)序所需的索引序列。使用PCR 對(duì)兩端帶有接頭的DNA 片段進(jìn)行擴(kuò)增并使用磁珠法純化PCR 產(chǎn)物。對(duì)得到的該長(zhǎng)度的DNA 片段進(jìn)行平行隨機(jī)測(cè)序，通過(guò)對(duì)每條DNA 片段檢測(cè)其前25個(gè)或36個(gè)堿基(由廠家提供的不同讀長(zhǎng)的測(cè)序試劑盒決定)，然后通過(guò)對(duì)這些確定了一段序列的特征DNA 片段與參考序列的比對(duì)，將這些片斷歸類到每條染色體。計(jì)算歸類到每條染色體的片段數(shù)量占總片段數(shù)量的百分比。如果胎兒是21－三體，則21 號(hào)染色體的特征片段的量將有過(guò)度表達(dá)，也就是說(shuō)歸屬于21 號(hào)染色體的特征DNA 片斷的比例將有所升高，通過(guò)對(duì)這種微小的升高進(jìn)行區(qū)分，根據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)經(jīng)驗(yàn)設(shè)定一個(gè)閾值(Z Score)，篩選出超過(guò)該閾值的樣本，從而檢測(cè)出患有相應(yīng)染色體非整倍體疾病的胎兒。

4 無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前診斷與傳統(tǒng)診斷方法的特點(diǎn)對(duì)比

傳統(tǒng)的唐氏篩查采用在孕早期超聲檢測(cè)胎兒NT 值聯(lián)合母體血清中的PAPP－A［3］，在孕中期檢查母體血清中的AFP、hCG、uE3( +Inhibin－A)，準(zhǔn)確率(即敏感性)在64%－96%［4］，該方法一方面只能達(dá)到篩查出部分病例(即64%－96%) 的目的，另一方面，高于5%的孕婦會(huì)得到高危結(jié)果［5］( 即特異性約為95%)，按照染色體非整倍體疾病的發(fā)病率推算，這些得到高危結(jié)果的孕婦中約98%其實(shí)懷有健康胎兒，然而在得到高危結(jié)果后，孕婦需要通過(guò)有創(chuàng)的羊水穿刺或臍帶穿刺等進(jìn)行染色體核型分析來(lái)進(jìn)行確診(該技術(shù)的準(zhǔn)確率約為100%)，從而決定胎兒的去留，而穿刺會(huì)有1%左右的流產(chǎn)率，從而成為很多孕婦顧忌之處。經(jīng)過(guò)多年的研究，利用第二代測(cè)序技術(shù)檢測(cè)母體外周血中的胎兒游離DNA 可以克服上述缺陷。于是當(dāng)高通量深度測(cè)序技術(shù)走向成熟后該技術(shù)也得以從理論走向了臨床現(xiàn)實(shí)［6］。

5 無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前診斷技術(shù)的局限

由于無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前檢測(cè)技術(shù)可以對(duì)每條染色所占總?cè)旧w的比例進(jìn)行精確定量，從而彌補(bǔ)了血清學(xué)篩查方法不能檢測(cè)13－三體染色體數(shù)目異常的不足，并且該方法還能夠?qū)Υ蟛糠中匀旧w的非整倍體情況進(jìn)行檢測(cè)。

盡管目前大多數(shù)相關(guān)機(jī)構(gòu)只是對(duì)13、18 和21號(hào)染色體的檢測(cè)情況出具報(bào)告［7］，但就其原理和數(shù)據(jù)分析的過(guò)程可以認(rèn)為，理論上該技術(shù)對(duì)任何一條染色體的常規(guī)非整倍體檢測(cè)都具有同樣的高敏感性和特異性，只是因?yàn)槟壳八玫臄?shù)學(xué)模型尚缺乏臨床數(shù)據(jù)的支持和檢驗(yàn)。

另外，目前該技術(shù)的難點(diǎn)還集中在三個(gè)方面:雙胎和多胎妊娠的檢測(cè);性染色體非整倍體的檢測(cè);嵌合型、平衡異位型染色體非整倍體以及染色體微重復(fù)和微缺失的檢測(cè)。對(duì)于雙胎及多胎妊娠，以雙胎妊娠為例，研究發(fā)現(xiàn)，其總DNA 中cffDNA 的含量大于相同孕周單胎妊娠的cffDNA 含量，但同時(shí)又小于其二倍，所以，該技術(shù)能夠檢出雙胎及多胎妊娠胎兒染色體非整倍體是否存在，但無(wú)法具體到個(gè)體［8］，盡管如此，該方法依舊為決定后續(xù)是否需要進(jìn)行胎兒染色體核型分析提供了一定的依據(jù)［9］。對(duì)于性染色非整倍體的檢測(cè)，由于對(duì)母體和胎兒的游離DNA 不加區(qū)分隨機(jī)測(cè)序，故對(duì)于XXY 三體型、XYY三體型的性染色體非整倍體必須結(jié)合孕周考慮，并增加測(cè)序的覆蓋深度( coverage) 進(jìn)行檢測(cè)，目前尚存在一定難度，對(duì)于X 單體型、XXX 三體型的性染色體非整倍體，理論上具有和檢測(cè)其他染色體同樣的敏感性和特異性。對(duì)于嵌合型、平衡異位型染色體非整倍體以及染色體微重復(fù)和微缺失的檢測(cè)，目前還不具備有效的方法和數(shù)據(jù)，這是該技術(shù)的局限性。

表1 篩查指標(biāo)與存在問題

6 總結(jié)

經(jīng)過(guò)多年的研究、實(shí)踐和改進(jìn)，這項(xiàng)基于母體外周血中游離胎兒DNA 片段測(cè)量的無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前檢測(cè)方法，在與高通量測(cè)序技術(shù)的結(jié)合下，逐漸走向成熟，并應(yīng)用于臨床。與傳統(tǒng)的通過(guò)超聲技術(shù)以及檢測(cè)血清中各種激素的篩查技術(shù)相比，該技術(shù)具有經(jīng)過(guò)多方論證的，顯著提高的敏感性和特異性［11］。而與作為產(chǎn)前診斷金標(biāo)準(zhǔn)的染色體核型分析技術(shù)相比，該技術(shù)又以取樣的無(wú)創(chuàng)性見長(zhǎng)。隨著二代測(cè)序成本的不斷下降，該技術(shù)有望越來(lái)越廣泛地應(yīng)用于臨床，目前推薦的流程是，首先通過(guò)該技術(shù)對(duì)幾乎全部孕婦進(jìn)行篩查［11］，其優(yōu)越的敏感性可以篩出高于99%的病例，與此同時(shí)，其出色的特異性又使得只有不足1%的孕婦需要接受下一步的有創(chuàng)診斷［12］，極大地提高非整倍體疾病的檢出率的同時(shí)降低了為診斷而造成的損失，具有杰出的社會(huì)價(jià)值。

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