方 明 康 樂 陳英杰 劉 健 馬君燕 陶雅軍

(大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，大連 116001)

乳腺癌是一種異質(zhì)性疾病，臨床病理分型較為復(fù)雜，因此根據(jù)乳腺癌基因表達(dá)譜對每一型乳腺癌患者進(jìn)行個體化治療非常重要。三陰性乳腺癌(Triple negative breast cancer，TNBC)是乳腺癌的一種亞型，指雌激素受體(Estrogen receptor，ER)、孕激素受體(Progesterone receptor，PR)均陰性且人類表皮生長因子受體2(Human epidermal growth factor receptor-2，HER-2)無過表達(dá)的乳腺癌。TNBC約占全部乳腺癌的10%～17%，和其他類型乳腺癌相比，其更富有侵襲性，轉(zhuǎn)移早、復(fù)發(fā)率高，患者生存時(shí)間明顯縮短［1-3］。

盡管還沒有明確的鑒定標(biāo)志，但電鏡研究已揭示位于乳腺導(dǎo)管基底及其上部、數(shù)量極少、未分化呈電子半透明狀的細(xì)胞即為乳腺干細(xì)胞［4］。成體干細(xì)胞因其壽命長且相對未分化，能夠累積各種突變，因此成為癌癥發(fā)生的可能靶標(biāo)。在三陰性乳腺癌組織中含有較多的基底樣型癌細(xì)胞，乳腺癌干細(xì)胞可能位于其中，故推測三陰性乳腺癌患者的預(yù)后較其他類型乳腺癌差的重要原因是其腫瘤組織中乳腺癌干細(xì)胞的數(shù)量更多或活化程度更高。Smoothened(SMO)基因是參與調(diào)控腫瘤干細(xì)胞活化的重要基因，信號轉(zhuǎn)導(dǎo)子及轉(zhuǎn)錄活化子3(Signal transducers and activators of transcription，STAT3)在腫瘤干細(xì)胞自我維持與更新中具有重要作用，因此亦被看做是參與調(diào)控腫瘤干細(xì)胞的重要基因。MMP-9在腫瘤的侵襲、浸潤等方面具有重要作用。本研究旨在通過研究SMO、STAT3和MMP-9在三陰性乳腺癌、乳腺增生和正常乳腺組織中的表達(dá)差異及與三陰性乳腺癌臨床病理因素的關(guān)系，探討它們在乳腺癌干細(xì)胞激活及在三陰性乳腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料 33例三陰性乳腺癌、30例乳腺增生及18例癌旁正常乳腺組織石蠟標(biāo)本均采集自2008年5月～2012年11月大連市中心醫(yī)院病理科存檔標(biāo)本。33例乳腺癌患者術(shù)前均未接受放療、化療、激素或免疫治療，患者平均年齡52.3歲，病理類型均為浸潤性導(dǎo)管癌，病理分期依據(jù)AJCC標(biāo)準(zhǔn)［5］，其中Ⅰ期8例、Ⅱa期11例、Ⅱb期6例、Ⅲa期4例和Ⅳ期4例。

1.2 試劑與方法 SMO兔抗人單克隆抗體(ab72130)、STAT3兔抗人單克隆抗體(ab15523)均購自英國Abcam公司。鼠抗人MMP-9單克隆抗體、SP廣譜超敏試劑盒、DAB酶底物顯色劑等均購于福建邁新生物技術(shù)開發(fā)公司。實(shí)驗(yàn)分為三陰性乳腺癌組、乳腺增生組及正常乳腺組，免疫組化SP法及DAB顯色操作步驟均按照說明書進(jìn)行。按照抗體說明用已知卵巢癌陽性切片作為SMO陽性對照，子宮內(nèi)膜腺癌陽性切片作為STAT3陽性對照，基底細(xì)胞癌陽性切片作為MMP-9陽性對照，以PBS代替一抗作為陰性對照。

1.3 結(jié)果判定 SMO和MMP-9蛋白陽性表達(dá)均為胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒，STAT3蛋白陽性表達(dá)為胞核內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒。免疫組化結(jié)果采用半定量法進(jìn)行判定，根據(jù)染色密度(陰性=0、弱陽性=1、中度陽性=2、強(qiáng)陽性=3)和陽性細(xì)胞百分比(0=陰性、1=＜25%、2=25%～50%、3=51%～75%、4=＞75%)的乘積計(jì)算5個高倍視野的免疫反應(yīng)評分(Immuno-Reactive-Score，IRS)。最后結(jié)果:陰性(IRS:0):－，弱陽性(IRS:1-4):+，中度陽性(IRS:5-8):++，強(qiáng)陽性(IRS:9-12):+++。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 數(shù)據(jù)處理應(yīng)用SPSS 14.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，采用 χ2檢驗(yàn)對 SMO、STAT3、MMP-9蛋白在三陰性乳腺癌、乳腺增生和正常乳腺組織中的表達(dá)進(jìn)行分析，用Spearman等級相關(guān)分析SMO、STAT3、MMP-9在乳腺癌組織中表達(dá)的相關(guān)性，生存分析采用Cox回歸的多因素分析，P＜0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SMO、STAT3、MMP-9 蛋白在三陰性乳腺癌、乳腺增生和正常乳腺組織中的表達(dá) SMO蛋白在三陰性乳腺癌和乳腺增生組織中的陽性表達(dá)率分別為90.9%和60.0%，在正常乳腺組織中無表達(dá);STAT3蛋白在三陰性乳腺癌和乳腺增生組織中的陽性表達(dá)率分別為96.9%和73.3%，在正常乳腺組織中無表達(dá);MMP-9蛋白在三陰性乳腺癌和乳腺增生組織中的陽性表達(dá)率分別為90.9%和36.7%，在正常乳腺組織中無表達(dá);SMO、STAT3和MMP-9蛋白表達(dá)在三陰性乳腺癌、乳腺增生及正常乳腺組織中均有顯著差異(均 P＜0.05)，見表1、圖1。

表1 SMO、STAT3、MMP-9蛋白在三陰性乳腺癌、乳腺增生和正常乳腺組織中的表達(dá)Tab.1 Expression of SMO，STAT3 and MMP-9 in TNBC，mammary hyperplasia and normal breast tissue

表2 SMO、STAT3、MMP-9蛋白表達(dá)與三陰性乳腺癌臨床病理因素的關(guān)系Tab.2 Relationships between expression of SMO，STAT3，MMP-9 and clinicopathological parameters in TNBC

圖2 三陰性乳腺癌患者生存情況Fig.2 Survival data of TNBC

2.2 SMO、STAT3、MMP-9 蛋白表達(dá)與乳腺癌臨床病理因素的關(guān)系 由表2可知，SMO的表達(dá)與乳腺癌組織學(xué)分級、pTNM 分期有關(guān)(P=0.036，P=0.002)，其表達(dá)隨著組織學(xué)分級和臨床分期的增高而增高;STAT3的表達(dá)亦與乳腺癌組織學(xué)分級、pTNM 分期有關(guān)(P=0.004，P=0.038)，其表達(dá)隨著組織學(xué)分級和臨床分期的增高而增高;SMO和STAT3的表達(dá)均與患者年齡、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)(均P＞0.05);MMP-9的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P=0.009)，與患者年齡、組織學(xué)分級以及臨床分期均無關(guān)(均P＞0.05)。Spearman相關(guān)檢驗(yàn)顯示SMO和STAT3(r=0.361，P=0.039)、SMO 和 MMP-9(r=0.633，P=0.000)、MMP-9 和 STAT3(r=0.803，P=0.000)在三陰性乳腺癌中的表達(dá)均相關(guān)。

2.3 三陰性乳腺癌患者預(yù)后相關(guān)因素 三陰性乳腺癌患者生存情況見圖2，Cox回歸分析顯示，最終進(jìn)入回歸方程的是 SMO［Exp(B)=10.677，P=0.022］和pTNM 分期［Exp(B)=1.889，P=0.002。］

3 討論

目前關(guān)于三陰性乳腺癌發(fā)生發(fā)展的確切機(jī)制尚不清楚，但有研究認(rèn)為癌癥干細(xì)胞愈豐富的腫瘤患者其預(yù)后愈差。由于三陰性乳腺癌具有復(fù)發(fā)率高、易轉(zhuǎn)移、耐藥及生存期短等特點(diǎn)，因此推測在三陰性乳腺癌組織中可能具有較多的處于活化狀態(tài)的癌癥干細(xì)胞，并且相關(guān)調(diào)控基因的表達(dá)異常在癌癥干細(xì)胞的活化過程中起了非常重要的作用。SMO基因?qū)儆谠┗颍幋aSMO蛋白負(fù)責(zé)Hedgehog信號通路的傳導(dǎo)，對于癌癥干細(xì)胞自我更新及分化潛能的維持至關(guān)重要，其突變與皮膚、腦、肝、肺、前列腺、胰腺、卵巢等器官的惡性腫瘤發(fā)生均有關(guān)［6-8］。本研究發(fā)現(xiàn)在乳腺增生組織中SMO的表達(dá)增加，且與正常乳腺組織相比具有顯著性差異，提示在乳腺組織中細(xì)胞的增殖與SMO的激活有關(guān)，推測SMO可能參與誘導(dǎo)乳腺干細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞周期以擴(kuò)大乳腺干細(xì)胞池進(jìn)而促進(jìn)乳腺增生的形成。而與乳腺增生相比，在三陰性乳腺癌組織中SMO的表達(dá)亦明顯增加，提示在正常乳腺-乳腺增生-三陰性乳腺癌這一連續(xù)發(fā)展的過程中SMO的激活可能參與乳腺干細(xì)胞向乳腺癌干細(xì)胞的轉(zhuǎn)化從而促進(jìn)乳腺癌的發(fā)生。Moraes等［9］報(bào)道在MMTV啟動子控制下的人SMO(SmoM2)激活可導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因鼠乳腺導(dǎo)管增生、增強(qiáng)原始乳腺球的形成能力、促進(jìn)早期乳腺癌的發(fā)展，這與本研究結(jié)果一致。STAT3基因是人類胚胎期干細(xì)胞自我更新的重要基因，在很多上皮組織惡性腫瘤中均有激活?；罨腟TAT3介導(dǎo)多種基因的表達(dá)，如twist、snail、IL-8以及干細(xì)胞標(biāo)志Oct-4等，可抑制腫瘤細(xì)胞凋亡、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖與轉(zhuǎn)移、抑制抗腫瘤免疫應(yīng)答等，與腫瘤患者的預(yù)后密切相關(guān)［10，11］。此外，有研究表明STAT3的激活能促進(jìn)癌癥干細(xì)胞的增殖并抑制其分化，而抑制STAT3的表達(dá)則可阻止癌癥干細(xì)胞的生長［12］。本研究發(fā)現(xiàn)在乳腺增生和三陰性乳腺癌組織中STAT3的表達(dá)均增加，且STAT3的表達(dá)在三陰性乳腺癌、乳腺增生和正常乳腺組織中均具有顯著性差異，提示STAT3的激活可能參與乳腺干細(xì)胞向乳腺癌干細(xì)胞的轉(zhuǎn)化進(jìn)而促進(jìn)乳腺癌的發(fā)生。在本研究中SMO和STAT3蛋白的表達(dá)均隨著組織學(xué)分級和臨床分期的增高而增高，且SMO的表達(dá)與STAT3具有相關(guān)性，提示SMO和STAT3可能協(xié)同調(diào)控乳腺癌干細(xì)胞的激活進(jìn)而參與到乳腺癌的進(jìn)一步發(fā)展過程中。MMP-9是降解細(xì)胞外基質(zhì)的主要酶類，可分解基底膜中的纖維連接蛋白和層粘連蛋白促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移，MMP-9亦是STAT3的下游作用因子［13］，而MMP-9的活化又可進(jìn)一步激活STAT3［14］。本研究顯示MMP-9的表達(dá)與乳腺癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，且MMP-9的表達(dá)與SMO和STAT3的表達(dá)均明顯相關(guān)，提示活化的SMO和STAT3可能通過與MMP-9的相互作用進(jìn)而促進(jìn)乳腺癌的浸潤和轉(zhuǎn)移。本研究還發(fā)現(xiàn)SMO的高表達(dá)與三陰性乳腺癌患者的生存期短明顯相關(guān)，進(jìn)一步說明SMO的靶標(biāo)可能就是干細(xì)胞。這些研究結(jié)果提示SMO和STAT3在三陰性乳腺癌的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用，其可作為三陰性乳腺癌患者治療的重要靶標(biāo)，但SMO和STAT3如何促進(jìn)乳腺干細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化，SMO和STAT3之間的相互關(guān)系等問題還需深入研究。

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