張大偉 呂恒娟 劉貴波 李明秋 (牡丹江醫(yī)學(xué)院，黑龍江 牡丹江 570)

隨著人們對腫瘤淋巴道轉(zhuǎn)移的研究不斷深入，關(guān)于淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞(LECs)的形態(tài)學(xué)特征、生理功能、生物特性及其在病理過程的作用也逐漸成為研究熱點(diǎn)。1984年Jottstcm和Walker首次成功地分離、培養(yǎng)了牛腸系膜LECs，并觀察了其形態(tài)學(xué)特征〔1〕。近年來，隨著分子生物學(xué)和細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的飛速發(fā)展，許多學(xué)者成功地進(jìn)行了多種組織的 LECs離體培養(yǎng)〔2～6〕。本研究從原代培養(yǎng)豬胸導(dǎo)來源的內(nèi)皮細(xì)胞入手，研究LECs的形態(tài)學(xué)特性，并創(chuàng)建了可靠的培養(yǎng)方法，將為今后進(jìn)一步研究LECs的功能和在腫瘤轉(zhuǎn)移中的作用機(jī)制提供可靠的材料。

1 材料和方法

1.1 材料 取豬胸主動脈及其后面的組織(其內(nèi)含胸異管)，用含有雙抗(含青霉素鏈霉素各200 U/ml)和兩性霉素 B 50 U/ml預(yù)冷的D-Hanks沖洗3次，盡可能去除血液和雜質(zhì)，然后放入裝有含雙抗的D-Hanks液瓶中，置于冰袋預(yù)冷的保溫箱內(nèi)送實(shí)驗(yàn)室，立即進(jìn)行試驗(yàn)。

1.2 LECs的分離純化培養(yǎng)及傳代 將胸導(dǎo)管兩端游離，并插入導(dǎo)管，用止血鉗將近心端導(dǎo)管結(jié)扎，在遠(yuǎn)心端向胸導(dǎo)管內(nèi)注入膠原酶(1 g/L)，至胸導(dǎo)管充盈為止。將其置于37℃的恒溫箱內(nèi)消化10～15 min，用培養(yǎng)液加壓沖洗管腔，將消化液和沖洗液離心(1 000 r/min，10 min)，吸去上清液，用培養(yǎng)液輕輕混懸細(xì)胞。將細(xì)胞接種于預(yù)先用明膠或多聚賴氨酸噴涂的培養(yǎng)皿中，然后置于37℃，體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。每隔2～3 d更換培養(yǎng)液1次。約10%細(xì)胞匯合生長形成單層。當(dāng)內(nèi)皮細(xì)胞生長形成單層時，進(jìn)行1∶3傳代培養(yǎng)。

1.3 免疫熒光染色鑒定LECs 原代LECs傳代于24孔板中繼續(xù)培養(yǎng)至60% ～80%，用預(yù)溫磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌3次，4%多聚甲醛室溫固定60～90 min，PBS洗滌2次，0.5%Triton-100處理細(xì)胞30 min，PBS洗滌2次，山羊血清用PBS按1∶10的比例稀釋后室溫封閉20 min，后棄去多余液體，分別用鼠抗人血管皮生長因子受體(VEGR)-3(1∶200)，淋巴管內(nèi)皮透明質(zhì)酸受體-1(LYVE-1)(1∶400)抗體4℃孵育過夜，PBS洗滌3次，羊來源的二抗(1∶100)室溫孵育30 min，PBS洗滌2次，鏈霉親合素-生物素復(fù)合物(SABC)-異硫氰酸熒光素(FITC)(1∶100)室溫孵育30 min，PBS洗滌4次，倒置熒光顯微鏡下觀察拍照分析。

1.4 透射電鏡觀察LECs超微結(jié)構(gòu) 收集培養(yǎng)的豬胸導(dǎo)管內(nèi)皮細(xì)胞，離心后用3%戊二醛固定，1%鋨酸固定，經(jīng)脫水、浸透、包埋，制成半薄切片，然后制成超薄切片，透射電鏡觀察。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞的原代培養(yǎng)及傳代 原代細(xì)胞培養(yǎng)3～5 h后，大部分活力較高的內(nèi)皮細(xì)胞完成貼壁;12～24 h后，內(nèi)皮細(xì)胞已鋪展形成由數(shù)個細(xì)胞組成的細(xì)胞群，每群細(xì)胞數(shù)目不等，形態(tài)呈梭形;培養(yǎng)18～24 h后，更換培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。在2～3 d內(nèi)，細(xì)胞生長緩慢，1 w后細(xì)胞分裂旺盛，進(jìn)入對數(shù)生長期;10 d后，細(xì)胞呈生長密集狀并匯合形成單層，呈特征性“鵝卵石狀”或“鋪路石狀”鑲嵌排列生長并有接觸抑制現(xiàn)象，無重疊生長。當(dāng)淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞形成單層時進(jìn)行傳代培養(yǎng)，25～30 min后，淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞開始貼壁生長，傳代培養(yǎng)1 w后內(nèi)皮細(xì)胞匯合形成單層。見圖1。

圖1 細(xì)胞原代培養(yǎng)(×100)

2.2 免疫熒光染色鑒定LECs 免疫熒光檢測發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)中所分離的細(xì)胞絕大部分均表達(dá)淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記分子LYVE-1和VEGFR-3。綜合分析該細(xì)胞的純度＞95%，淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞特征明確，可以用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。見圖2。

2.3 LECs超微結(jié)構(gòu) 在透射電鏡下，內(nèi)皮細(xì)胞呈卵圓形、短梭形、多角形或不規(guī)則形，從細(xì)胞膜上偶有一些長的突起。細(xì)胞核大，核仁清晰，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)含有豐富的吞飲小泡，并有較多的線粒體和粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，在對數(shù)生長期可見雙核仁。見圖3。

圖2 免疫熒光染色鑒定LECs

圖3 透射電鏡觀察LECs超微結(jié)構(gòu)

3 討論

LECs在多次傳代后性狀會發(fā)生改變，因此在目前階段認(rèn)為原代培養(yǎng)LECs是比較可靠的實(shí)驗(yàn)方法，而LECs的長期培養(yǎng)建系長期以來都是一個難題。取材過程中傳統(tǒng)方法是把胸導(dǎo)管完全游離，用鑷子和眼科剪子仔細(xì)剝除胸導(dǎo)管表面的脂肪和纖維組織〔5～7〕，但在修剪胸導(dǎo)管過程中，常把胸導(dǎo)管小的屬支剪斷，使胸導(dǎo)管有一些漏點(diǎn)，以至于很難取到足夠長的胸導(dǎo)管進(jìn)行消化。

LECs活力有限，對培養(yǎng)條件要求較高。ECM是培養(yǎng)內(nèi)皮細(xì)胞的專用培養(yǎng)基，其含有必需氨基酸、維生素和無機(jī)鹽;ECGS能顯著提高細(xì)胞的活力，縮短細(xì)胞的生長周期，未加入ECGS的培養(yǎng)基接種LECs后發(fā)現(xiàn)其擴(kuò)增有限，難以生長。

目前 LECs的標(biāo)記分子如 LYVE-1，VEGFR-3，Prox-1，Podoplanin等已經(jīng)得到國內(nèi)外學(xué)者的證實(shí)，其特異性均比較高〔8～11〕。本文采用兩種標(biāo)記分子對所培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光細(xì)胞化學(xué)鑒定，排除所培養(yǎng)的細(xì)胞不是LECs的可能，尤其是在消化過程中可能造成污染的成纖維細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞的干擾，同時也排除了生物學(xué)特性與LECs相近的微血管內(nèi)皮細(xì)胞的可能。目前也有研究報道部分炎性細(xì)胞如腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞，樹突細(xì)胞也可表達(dá)LYVE-1〔12〕，但是此類細(xì)胞在本實(shí)驗(yàn)條件下難以生長。結(jié)果表明培養(yǎng)的LECs純度比較高，達(dá)到95%可以用于進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)。

透射電鏡觀察到，LECs胞質(zhì)內(nèi)有發(fā)達(dá)的線粒體和粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞器，說明培養(yǎng)的淋巴管內(nèi)皮功能較活躍。胞質(zhì)中有豐富的吞飲小泡，這些小泡有運(yùn)輸物質(zhì)的作用，這表明細(xì)胞有很強(qiáng)的吞飲能力。內(nèi)皮細(xì)胞核淡染，以常染色質(zhì)為主，核仁大而明顯。在對數(shù)生長期細(xì)胞核內(nèi)可見雙核仁，這表明LECs具有旺盛的增殖分裂能力。此外，該細(xì)胞在體外培養(yǎng)至第3代時仍保持了內(nèi)皮細(xì)胞的特性。

本實(shí)驗(yàn)改進(jìn)了膠原酶灌注消化豬胸導(dǎo)管得到LECs的方法，可以用較少的材料獲得數(shù)量和純度均較高的LECs，成功率高，這為進(jìn)一步研究LECs生理功能、免疫反應(yīng)、生長發(fā)育提供有效的平臺。此外，本實(shí)驗(yàn)還觀察了LECs的超微結(jié)構(gòu)，為進(jìn)一步研究LECs提供了形態(tài)學(xué)依據(jù)。

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