孫克康 仲 寧 沈曉軍 楊 棟 劉 剛 甘明強 吳曉陽

(昆山市第一人民醫(yī)院 江蘇大學附屬昆山醫(yī)院心胸胃腸外科，江蘇 昆山 215300)

結(jié)直腸癌發(fā)病率約占所有腫瘤的10% ～15%，手術治療是首選的治療方式〔1〕，但相當一部分患者確診時已處于中晚期，因此化療、輔助化療成為結(jié)直腸癌重要的治療手段。順鉑作為重要的化療藥物在結(jié)直腸癌的化療中發(fā)揮重要的作用。ErbB2轉(zhuǎn)錄因子1(TOB1)基因是B細胞異位基因/erbB2轉(zhuǎn)錄因子(BTG/TOB1)抗增殖蛋白家族中研究最多的一個成員，大量的研究證實TOB1基因在抑制肺癌細胞惡性增殖、轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要的作用〔2～4〕。本實驗研究順鉑對結(jié)直腸癌HCT-116細胞中TOB1表達的影響，為TOB1的抗癌研究及結(jié)直腸癌臨床化療療效判斷提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 人結(jié)直腸癌細胞株HCT-116購自美國細胞收藏中心(American type culture collection)，由本室保藏。DMEM細胞培養(yǎng)基、0.25%胰酶、胎牛血清購自美國Invitrogen公司。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、Go Taq Green Master Mix PCR擴增試劑盒購自美國Invitrogen公司，PCR反應試劑盒購自美國Promega公司，PCR引物采用Premier5.0軟件設計，交由Invitrogen公司合成。實驗所需其余試劑購自上海生物工程技術有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 細胞培養(yǎng)采用含10%胎牛血清的DMEM細胞培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2條件下常規(guī)培養(yǎng)，每2 d換液1次，3 d傳代1次。

1.2.2 RT-PCR檢測TOB1對腫瘤轉(zhuǎn)移相關基因表達的調(diào)控按Trizol試劑盒說明書提取總RNA，用DEPC水溶解RNA，紫外分光光度計分別測定RNA純度(A260 nm/A280 nm＞1.80)。各取總RNA 5 μg，采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進行第一鏈cDNA合成(詳見逆轉(zhuǎn)錄試劑盒參考說明)。PCR所需引物序列見表1，反應條件參見文獻〔5〕。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，在凝膠成像儀上觀察、拍照。通過quantity one圖像分析軟件對各條帶灰度進行檢測，以內(nèi)參GAPDH的灰度為標準，各組mRNA的灰度值與之相比。

表1 RT-PCR實驗所需的引物名稱及序列

1.2.3 Western印跡法檢測TOB1對細胞轉(zhuǎn)移和侵襲相關蛋白表達的調(diào)控 收集細胞，IP裂解液裂解，離心收集蛋白樣品，BCA法測定蛋白濃度。每組樣品取50 μg總蛋白采用10%的聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，室溫下以5%脫脂奶粉進行非特異性的抗原封閉1 h，隨后加入特異性一抗溶液室溫作用1 h，0.1%Tween PBS洗滌后與HRP耦聯(lián)的二抗溶液室溫作用1 h，洗滌后采用化學發(fā)光顯色試劑盒進行曝光，同一張膜測定β-actin蛋白作為樣品內(nèi)參?？筎OB1(N-20)單克隆抗體稀釋倍數(shù)1∶200，抗-Actin(C4)單克隆抗體、辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗鼠IgG、驢抗羊IgG的稀釋倍數(shù)均為1∶1 000。通過quantity one圖像分析軟件對各條帶灰度進行檢測，以內(nèi)參-Actin的灰度為標準，各組蛋白的灰度值與之相比。

1.2.4 免疫熒光 胰酶消化處于指數(shù)生長期的細胞，按照一定的數(shù)量接種在0.14 mm厚的玻璃培養(yǎng)皿，(直徑3.5 cm)，48 h用20 mol/L順鉑處理細胞，2 h后用 PBS洗3遍，每次5 min，4%多聚甲醛固定30 min，PBS 洗3 遍，每次5 min，0.2%曲拉通破膜30 min，PBS洗3遍，每次5 min，1%BSA 封閉，4℃避光過夜;加入TOB1一抗(1∶200)4℃避光過夜;PBS避光洗3遍，加入FITC標記的兔抗鼠 IgG(1∶500)4°C避光1 h，PBS避光洗3遍，每次5 min，加入DAPI避光30 min，PBS避光洗3遍，每次5 min，加入防淬滅封閉液。采用激光共聚焦顯微鏡觀察488激光激發(fā)下綠色熒光。所有實驗均重復3次以上。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS17.0統(tǒng)計學軟件進行t檢驗和方差分析。

2 結(jié)果

2.1 不同劑量順鉑對TOB1 mRNA和蛋白表達水平的影響不同劑量順鉑處理后TOB1 mRNA表達水平與對照組相比均明顯增加(P＜0.05)，并且TOB1的表達水平隨順鉑劑量增加呈逐漸增加趨勢;不同劑量的順鉑處理后TOB1蛋白的表達水平比對照組明顯增加(P＜0.05)，同時TOB1蛋白表達水平隨順鉑劑量增加逐漸增加，見圖1。

2.2 順鉑處理后不同時間TOB1 mRNA和蛋白表達水平的變化 20 μmol/L順鉑處理2 h后TOB1 mRNA表達水平即開始增加(P＜0.05)，照射24 h后仍保持較高的表達水平;順鉑處理2 h后TOB1蛋白的表達水平明顯增加(P＜0.05)，照射24 h后仍保持較高的表達水平，見圖2。

2.3 順鉑誘導HCT-116細胞中TOB1向細胞核轉(zhuǎn)位 HCT-116細胞中TOB1主要分布在細胞質(zhì)，而20 μmol/L順鉑處理2 h后HCT-116細胞中TOB1主要分布在細胞核;說明順鉑處理后早期可誘導HCT-116細胞質(zhì)中TOB1向胞核內(nèi)轉(zhuǎn)位，見圖3。

圖1 不同劑量順鉑對TOB1 mRNA和蛋白表達水平的影響

圖2 順鉑處理后不同時間TOB1 mRNA和蛋白表達水平的變化

圖3 順鉑對TOB1細胞內(nèi)分布的影響

3 討論

結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展以及腫瘤細胞的浸潤轉(zhuǎn)移是一個多因素、多步驟的復雜過程，抑癌基因的失活在其中發(fā)揮著重要的作用。目前結(jié)直腸癌的早期診斷率還比較低，大多數(shù)患者在確診時已屬中晚期，且手術后的患者中仍有50%以上會出現(xiàn)復發(fā)或轉(zhuǎn)移?；熓侵委熗砥诨驈桶l(fā)轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌的主要手段，多年來順鉑是治療結(jié)直腸癌最主要的化療藥物之一。近年來，由于分子生物學技術的發(fā)展，對結(jié)直腸癌分子機制的研究不斷深入，部分腫瘤標志物及靶基因在治療前后表達水平的變化對判斷腫瘤短期療效及預后中有重要意義。

TOB1是1996年日本學者Matsuda在篩選與erbB2相互作用的蛋白時首次發(fā)現(xiàn)，因此被命名為erbB2轉(zhuǎn)導因子1。TOB1基因定位于染色體17q21，編碼含345個氨基酸的蛋白質(zhì)分子〔6〕。由于TOB1基因在細胞靜止期和抗細胞增殖中發(fā)揮重要的作用，其表達和功能的改變往往引起細胞的惡性進展，因此成為腫瘤學研究新的熱點〔7〕。本研究證實了順鉑可以誘導結(jié)直腸癌HCT-116細胞中TOB1的表達，并可以誘導細胞質(zhì)中TOB1向細胞核內(nèi)轉(zhuǎn)位，提示TOB1具有作為臨床結(jié)直腸癌化療靶基因的可能，該基因的靶向研究可能對肺癌臨床化療療效的判斷具有一定的指導作用。

1 Jemal A，Bray F，Center MM，et al.Global cancer statistics〔J〕.CA Cancer J Clin，2011;61(2);69-90.

2 Winkler GS.The mammalian anti-proliferative BTG/Tob protein family〔J〕.J Cell Physiol，2010;222(1):66-72.

3 O'malley S，Su H，Zhang T，et al.TOB suppresses breast cancer tumorigenesis〔J〕.Int J Cancer，2009;125(8):1805-13.

4 Tzachanis D，Boussiotis VA.Tob，a member of the APRO family，regulates immunological quiescence and tumor suppression〔J〕.Cell Cycle，2009;8(7):1019-25.

5 Jiao Y，Ge CM，Meng QH，et al.Adenovirus-mediated expression of Tob1 sensitizes breast cancer cells to ionizing radiation〔J〕.Acta Pharmacol Sin，2007;28(10):1628-36.

6 Jiao Y，Sun KK，Zhao L，et al.Suppression of human lung cancer cell proliferation and metastasis in vitro by the transducer of ErbB-2.1(TOB1)〔J〕.Acta Pharmacol Sin，2012;33:250-60.

7 Park GT，Seo EY，Lee KM，et al.Tob is a potential marker gene for the basal layer of the epidermis and is stably expressed in human primary keratinocytes〔J〕.Br J Dermatol，2006;154(3):411-8.