張 春 董海影 (寧夏醫(yī)科大學(xué)顱腦疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，寧夏 銀川 750004)

在腫瘤的血行轉(zhuǎn)移中，腫瘤細(xì)胞與血管內(nèi)皮黏附是轉(zhuǎn)移的重要環(huán)節(jié)之一〔1〕，針對這一靶點(diǎn)開展的抗黏附治療是抗腫瘤轉(zhuǎn)移的研究熱點(diǎn)之一〔2，3〕。研究發(fā)現(xiàn)，許多具有高度轉(zhuǎn)移能力的腫瘤細(xì)胞表面可以過度表達(dá)一種唾液酸化LewisX(sLeX)。sLeX與內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)的E-選擇素結(jié)合，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞與血管內(nèi)皮的黏附。姬松茸多糖(PAB)是從姬松茸菌絲體及子實(shí)體中提取出來的一種有效成分。本實(shí)驗(yàn)以sLeX-E選擇素介導(dǎo)的黏附為切入點(diǎn)，觀察低分子量姬茸多糖(LMPAB)抗腫瘤轉(zhuǎn)移作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 藥物及試劑 LMPAB由齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院醫(yī)藥研究所制備，褐色粉末，易溶于水，平均分子量為480 000。結(jié)構(gòu)分析顯示其主體結(jié)構(gòu)為β-(1→3)-D葡聚糖〔4〕。人結(jié)腸癌細(xì)胞Lovo、人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)均購自美國ATCC細(xì)胞庫;Recombinant Human TNF-α 購自 R＆D Systems，Inc;鼠抗 IgG+IgM(ab47830)datasheet購自Abcam公司;KM93購自Calbiochem公司;F12K培養(yǎng)基購自Sigma公司，RPMI 1640培養(yǎng)基購自Gibco公司，Rose Bengal購自Sigma公司，胎牛血清(FBS)購自Clark公司，EDTA購自Amresco公司，胰蛋白酶購自Gibco公司，RNA抽提試劑RNAiso和SYBR Ex-ScriptTM RT-PCR試劑盒購自TaKaRa公司;引物由TaKaRa公司設(shè)計(jì)和合成，其序列如下:GAPDH正義鏈:5'-GGCACAGTCAAGGCTGAGAATG-3'反義鏈:5'-ATGGTGGTGAAGACGCCAGTA-3'(143 bp);FUTⅦ:正義鏈:5'-TCACTGGCATGAATGAGAGC-3';反義鏈:5'-TGAAACCAACCCTCAAGGTC-3'。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) Lovo細(xì)胞用含10%新生牛血清的F12K培養(yǎng)液37℃、5%CO2的常規(guī)培養(yǎng)。HUVECs用含10%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)液37℃、5%CO2的常規(guī)培養(yǎng)。

1.3 黏附能力的測定〔5〕將96孔培養(yǎng)板培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞去除培養(yǎng)液后，每孔加濃度為2.5×105個(gè)/ml的 Lovo細(xì)200 μl，37℃孵育20 min;去除未黏附的腫瘤細(xì)胞，每孔加0.25%Rose Bengal 100 μl，室溫放置 5 min;去除染料 Rose Bengal，每孔加95% 乙醇;PBS(1∶1)200 μl，室溫放置 30 min;最后測定570 nm光密度值。

1.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測Lovo細(xì)胞表面sLeX的表達(dá) 對數(shù)生長期的Lovo細(xì)胞以1×106cell/ml接種于60 mm培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，待細(xì)胞融合至80%時(shí)，加入含不同濃度LMPAB的培養(yǎng)基，孵育48 h后，熒光標(biāo)記，流式細(xì)胞儀檢測。以陽性表達(dá)百分率表示Lovo細(xì)胞表面sLeX含量。

1.5 Real-time RT-PCR檢測Lovo細(xì)胞FUTⅦmRNA表達(dá)

1.5.1 提取總RNA 采用RNAiso Reagent提取總RNA，操作按說明書進(jìn)行，紫外分光光度法及瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA的含量、純度和完整性。

1.5.2 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng) 在2700型PCR System擴(kuò)增儀上進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，SYBR?ExScriptTMRT-PCR Kit說明書進(jìn)行cDNA合成，反應(yīng)參數(shù)為:反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)42℃ 15 min，反轉(zhuǎn)錄酶失活反應(yīng)95℃ 2 min。

1.5.3 real-time RT-PCR反應(yīng) PCR反應(yīng)采用SYBR Premix ExTaq試劑盒，在ABI7300熒光定量PCR儀上進(jìn)行PCR反應(yīng)。反應(yīng)條件如下:第一步是預(yù)變性，95℃預(yù)變性10 s，共1個(gè)循環(huán)。第二步是PCR反應(yīng)，95℃變性5 s，60℃退火31 s，共40個(gè)循環(huán)。整個(gè)過程中收集熒光，反應(yīng)結(jié)束后，使用Sequence Detection software version 11213軟件(Applied Biosystems公司)收集Ct(Threshold cycle)值，由熔解曲線判斷PCR反應(yīng)的特異性，采用2-△△Ct分析 FUTⅦ mRNA表達(dá)量。GAPDH和 FUTⅦ的擴(kuò)增，每樣本作2復(fù)孔，得到兩組平均 Ct值。通過2-△△Ct計(jì)算FUTⅦ相對mRNA表達(dá)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS13.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。數(shù)據(jù)以s表示。多組間差異的顯著性分析用單因素方差分析，進(jìn)一步組間比較用LSD檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 LMPAB對Lovo細(xì)胞與HUVECs黏附的影響 不同濃度的LMPAB孵育Lovo細(xì)胞48 h后，在5～20 μg/ml劑量范圍內(nèi)，LMPAB處理組黏附于HUVECs的Lovo數(shù)目與對照組相比減少(P ＜0.05)。見表1。

2.2 LMPAB對Lovo細(xì)胞表面sLeX表達(dá)的影響 流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示不同濃度的LMPAB對Lovo細(xì)胞表面sLeX表達(dá)具有抑制作用?？瞻讓φ战M的sLeX陽性表達(dá)率為(67.98±3.81)%。LMPAB 低劑量組(55.93 ±6.42)%，LMPAB 中劑量組(39.02 ±4.28)%，LMPAB 高劑量組(24.76 ±2.98)%。

2.3 LMPAB對Lovo細(xì)胞表達(dá)FUTⅦmRNA的影響 見表2。與對照組比較，LMPAB對Lovo細(xì)胞表達(dá)FUTⅦ mRNA具有抑制作用(P＜0.05)。

表1 不同劑量LMPAB抑制Lovo細(xì)胞黏附HUVECs的作用( s，n=5)

表1 不同劑量LMPAB抑制Lovo細(xì)胞黏附HUVECs的作用( s，n=5)

與空白對照組比較:1)P＜0.05

組別 OD570 抑制率(%)空白對照組28.62 ±2.96 0.602 ±0.025 6 -LMPAB 低劑量組 0.437 ±0.023 31) 27.34 ±3.87 LMPAB 中劑量組 0.461 ±0.048 11) 23.40 ±7.99 LMPAB 高劑量組 0.429±0.017 81)

表2 LMPAB對Lovo細(xì)胞FUTⅦmRNA表達(dá)的影響( s，n=5)

表2 LMPAB對Lovo細(xì)胞FUTⅦmRNA表達(dá)的影響( s，n=5)

與空白對照組比較:1)P＜0.05

組別CT(FUTVⅡ)CT(GAPDH)ΔΔCT 2-ΔΔCT 22.55 ±0.16 15.52 ±0.22 0 ±0.32 1.02 ±0.25 LMPAB 低劑量組 23.41 ±0.14 15.41 ±0.13 0.97 ±0.16 0.51 ±0.061)LMPAB 中劑量組 23.51 ±0.15 15.43 ±0.17 1.05 ±0.17 0.48 ±0.061)LMPAB 高劑量組 23.79 ±0.37 15.31 ±0.21 1.45 ±0.33 0.37 ±0.101)空白對照組

3 討論

腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移是一個(gè)極其復(fù)雜的多步驟的連續(xù)動(dòng)態(tài)過程，其中腫瘤細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞的相互作用是關(guān)鍵環(huán)節(jié)。腫瘤細(xì)胞脫離原發(fā)部位進(jìn)入血液循環(huán)，與特定臟器血管內(nèi)皮細(xì)胞的錨定黏附被認(rèn)為是器官特異性轉(zhuǎn)移關(guān)鍵性的第一步〔6〕。從腫瘤血行轉(zhuǎn)移過程中腫瘤細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞黏附的環(huán)節(jié)為切入點(diǎn)，針對瘤細(xì)胞黏附和遷移穿過內(nèi)皮細(xì)胞這一靶點(diǎn)開展的抗黏附治療是抗腫瘤轉(zhuǎn)移研究熱點(diǎn)之一〔3，7〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示LMPAB抑制腫瘤細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞黏附，進(jìn)而影響腫瘤轉(zhuǎn)移。

sLeX抗原屬于腫瘤相關(guān)糖類物質(zhì)，表達(dá)在腫瘤組織細(xì)胞表面糖酯及糖蛋白上的含有寡聚糖的一組碳水化合物抗原。腫瘤細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞的黏附能力與E-selectin的配體sLeX表達(dá)水平有關(guān)，sLeX在腫瘤轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用。以往的研究發(fā)現(xiàn)sLeX在結(jié)腸癌〔8〕、乳腺癌〔9〕等腫瘤高強(qiáng)度表達(dá)，并通過與其受體特異性結(jié)合在腫瘤轉(zhuǎn)移中起重要作用相一致。本研究發(fā)現(xiàn)LMPAB通過下調(diào)Lovo細(xì)胞表面的sLeX的表達(dá)，使Lovo與HUVECs的黏附作用減弱，提示LMPAB可能具有抗腫瘤轉(zhuǎn)移的作用。

研究顯示FucT-Ⅶ及其產(chǎn)物sLeX通過對細(xì)胞黏附、遷移和侵襲的影響而對肝癌細(xì)胞H7721的轉(zhuǎn)移能力起至關(guān)重要的作用〔10〕。李文樺等〔11〕發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染了 α1，3 FucT-Ⅶ后的人結(jié)直腸癌Lovo細(xì)胞的趨化性遷移能力和侵襲能力有了明顯的增強(qiáng)，轉(zhuǎn)染α1，3 FucT-Ⅶ后sLeX表達(dá)水平及糖蛋白CD24糖基化水平的明顯上升。α1，3 FucT-Ⅶ及其糖基化產(chǎn)物在促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移中的起著重要的作用。α1，3 FucT-Ⅶ基因能改變?nèi)私Y(jié)腸癌Lovo細(xì)胞的生物學(xué)行為，增強(qiáng)細(xì)胞趨化性遷移和侵襲等轉(zhuǎn)移表型。FucT-Ⅶ通過自身表達(dá)的上調(diào)或下調(diào)影響腫瘤細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移能力，表明LMPAB具有下調(diào)FUTⅦmRNA的表達(dá)的作用，從而抑制腫瘤細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的黏附，發(fā)揮抗腫瘤轉(zhuǎn)移的作用。

總之，LMPAB在體外抑制腫瘤細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的黏附作用可能與降低了Lovo細(xì)胞表面的sLeX的表達(dá)有關(guān)，sLeX表達(dá)下調(diào)可能通過下調(diào)FUTⅦmRNA表達(dá)而實(shí)現(xiàn)。

1 Gassmann P，Enns A，Haier J.Role of tumor cell adhesion and migration in organ-specific metastasis formation〔J〕.Oncologie，2004;27(6):577-82.

2 Joyce JA.Therapeutic targeting of the tumor microenvironment〔J〕.Cancer Cell，2005;7(6):513-20.

3 Steinman L.Blocking adhesion molecules as therapy for multiple sclerosis:natalizumab〔J〕.Nat Rev Drug Discov，2005;4(6):510-8.

4 劉吉成，孫建寧.低分子量姬松茸多糖提取分離及抗腫瘤活性篩選研究〔J〕.中華中醫(yī)藥雜志，2006;21(5):298-300.

5 Gamble JR，Vadas MA.A new assay for the measurement of the attachment of neutrophils and other cell types to endothelial cells〔J〕.J Immunol Methods，1988;109(2):175.

6 Glinskii OV，Huxley VH，Glinsky GV，et al.Mechanical entrapment is insufficient and intercellular adhesion is essential for metastatic cell arrest in distant organs〔J〕.Neoplasia，2005;7(5):522-7.

7 Joyce JA.Therapeutic targeting of the tumor microenvironment〔J〕.Canc-er Cell，2005;7(6):513-20.

8 Laferrière J，Houle F，Huot J.Adhesion of HT-29 colon carcinoma cells to endothelial cells requires sequential events involving E-selectin and integrin beta 4〔J〕.Clin Exp Metastasis，2004;21(3):257-64.

9 Shaker OG，Ay El Deen MA，Abd El-Rahim MT，et al.Gene expression of E-selectin in tissue and its protein level in serum of breast cancer patients〔J〕.Tumori，2006;92(6):524-30.

10 Qi HL，Zhang Y，Ma J，et al.Insulin/protein kinase B signalling path way upregulates metastasis-related phenotypes and molecules in H7721 human hepatocarcinoma cell line〔J〕.Eur J Biochem，2003;270(18):3795-805.

11 李文樺，羅建民，張 英，等.α1，3 FucT-Ⅶ基因轉(zhuǎn)染對人結(jié)腸癌LOVO 細(xì)胞的作用〔J〕.復(fù)旦學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)，2008;35(4):569-73.