蘇 強 楊俊卿 唐 捷 (南充市中心醫(yī)院藥學(xué)部，四川 南充 637000)

流行性病學(xué)調(diào)查研究結(jié)果提示，人類攝入鋁的途徑中95%主要來自于食物，而只有不到1%的量來自于空氣中粉塵鋁〔1〕。長期飲用含鋁濃度較高的水，AD 發(fā)病率明顯升高〔2〕。長期接觸大劑量的鋁可造成機體多個組織器官損害，并引起嚴(yán)重的CNS毒性，表現(xiàn)為行為認(rèn)知功能障礙、中樞神經(jīng)元損傷乃至神經(jīng)元退行性變，但其機制仍未徹底闡明。通過腦室給鋁，可使鋁異常沉積于腦皮層各區(qū)以及海馬，導(dǎo)致動物學(xué)習(xí)記憶功能的損害和神經(jīng)元退變〔3〕，但此腦損傷應(yīng)為急性損傷;同時腦室給鋁方式與臨床鋁經(jīng)口攝入途徑有很大差異，屬于有創(chuàng)性模型，因而有學(xué)者認(rèn)為其還不能稱為嚴(yán)格意義上的神經(jīng)元退變模型。因此，在本研究中采用大鼠長期灌胃給予鋁鹽的方法建立神經(jīng)元退變動物模型，并以此模型研究美洛昔康對慢性鋁過負(fù)荷致神經(jīng)元退變大鼠腦內(nèi)金屬離子含量的影響，期望從另一個視角探討慢性鋁過負(fù)荷致大鼠神經(jīng)元退變與腦內(nèi)金屬離子的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 動物與主要試劑 清潔級雄性Wistar大鼠40只，質(zhì)量220～250 g，由重慶醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，合格證書號SCXK(渝)20020003。六水三氯化鋁(國產(chǎn)分析純)，葡萄糖酸鈉(國產(chǎn)分析純)，等離子體原子發(fā)射光譜檢測(解放軍后勤工程學(xué)院進行)。

1.2 方法

1.2.1 慢性鋁過負(fù)荷致神經(jīng)元退變大鼠模型的建立 實驗動物在實驗條件下飼養(yǎng)3 d以適應(yīng)實驗環(huán)境。將實驗動物分為4組，每組10只大鼠，即正常對照組、慢性鋁過負(fù)荷模型組、美洛昔康3 mg/kg組和美洛昔康1 mg/kg組。稱取17.9 g AlCl3·6 H2O及9.9 g葡萄糖酸鈉溶于一定量雙蒸水中，待溶液清澈后用0.1 mol/L NaOH將溶液滴定到pH 6.0左右，用雙蒸水定容至100 ml，配制成含Al3+20 g/L的葡萄糖酸鋁溶液，慢性鋁過負(fù)荷模型組大鼠灌胃給予葡萄糖酸鋁(Al3+200 mg·kg-1·d-1)，每周5 d，連續(xù)20 w;正常對照組大鼠灌胃給予與藥物等體積的0.3%羧甲基纖維素鈉;美洛昔康1、3 mg/kg組在每次給予鋁鹽后30 min灌胃給予，每周灌胃5 d，連續(xù)20 w，灌胃體積為10 ml/kg。所有動物有關(guān)的實驗與操作均在學(xué)校道德與倫理委員會的指導(dǎo)和許可下進行。在20 w模型制備過程中，鋁鹽毒性造成部分大鼠死亡。

1.2.2 金屬離子測定 取-80℃冰箱保存的大鼠腦組織稱重，加入2 ml雙蒸水，勻漿，按8 ml/g腦濕重加入25%四乙基氫氧化銨溶液，80℃消化24 h至溶液澄清，加雙蒸水定容到10 ml，測定時用雙蒸水稀釋5倍。為了避免金屬離子的干擾，所有過程均采用一次性塑料試管。金屬離子含量采用等離子體原子發(fā)射光譜分光光度儀測定，用內(nèi)標(biāo)法直接測定，測定波長分 別 為:鋁 309.3 nm，鐵 238.2 nm，銅 224.7 nm，鋅206.2 nm。

2 結(jié)果

慢性鋁過負(fù)荷模型組中金屬離子含量(鋁、鐵、銅、鋅)明顯高于正常對照組，與模型組相比，美洛昔康給予能明顯降低大鼠海馬中金屬離子含量，與美洛昔康1 mg/kg組相比，美洛昔康3 mg/kg組大鼠海馬中金屬離子含量降低更為明顯，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0.05，P ＜0.01)。見表1。

表1 美洛昔康對慢性鋁過負(fù)荷大鼠腦組織金屬離子含量的影響( s，n=3)

表1 美洛昔康對慢性鋁過負(fù)荷大鼠腦組織金屬離子含量的影響( s，n=3)

與對照組比較:1)P ＜0.05;與模型組比較:2)P ＜0.05，3)P ＜0.01;與美洛昔康小劑量組比較:4)P ＜0.05

組別 鋁(μg/g)鐵(μg/g)銅(μg/g)鋅(μg/g)21.53 ±2.90 31.09 ±1.87 3.37 ±0.99 3.92 ±0.73鋁鹽模型組 61.17 ±9.251) 88.97 ±13.981) 10.09 ±0.921) 9.77 ±0.941)美洛昔康大劑量組 41.68 ±1.152)4) 43.32 ±2.852)4) 6.42 ±0.883) 6.37 ±0.453)4)美洛昔康小劑量組 46.46 ±2.242) 56.57 ±4.502) 7.65 ±0.452) 7.39 ±0.252)空白對照組

3 討論

眾所周知鋁具有明顯的神經(jīng)毒性，鑒于鋁中毒涉及學(xué)習(xí)記憶障礙和有文獻報道AD患者腦內(nèi)鐵代謝失衡〔4〕，人們推測鋁的神經(jīng)毒作用可能與影響腦鐵的代謝有關(guān)，但這種關(guān)系缺乏有力的直接證據(jù)。

在本實驗研究中，筆者采用長期灌胃給鋁的方法建立了神經(jīng)元退變大鼠模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與正常對照組大鼠相比，慢性鋁過負(fù)荷大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力明顯損害，同時，大鼠兩側(cè)海馬出現(xiàn)明顯的核固縮，細(xì)胞層次明顯減少，這與腦室給予鋁鹽、一氧化碳中毒等致腦損傷的海馬形態(tài)學(xué)改變特點相似〔5〕。結(jié)合大鼠行為學(xué)、病理學(xué)變化，筆者認(rèn)為本研究中長期灌胃給予葡萄糖酸鋁，可以導(dǎo)致大鼠神經(jīng)元退變，而與腦室給鋁模型相比，更能模擬臨床攝入鋁致人神經(jīng)毒性的方式。

研究發(fā)現(xiàn)鋁過負(fù)荷致神經(jīng)元退變與腦內(nèi)金屬離子水平關(guān)系非常密切。鐵是機體必需的一種重要微量元素，但是過量的鐵可通過Fenton反應(yīng)生成具有大量毒性極大的羥自由基，引發(fā)氧化應(yīng)激反應(yīng)，最終誘發(fā)神經(jīng)元退行性變〔6〕。其他金屬離子如銅、鋅是腦內(nèi)一些抗氧化性酶重要組成部分，如Cu-ZnSOD。何百成等〔7〕研究發(fā)現(xiàn)腦室給鋁導(dǎo)致急性腦損傷，小鼠腦組織鐵、銅、鋅水平明顯增加。羅映等〔8〕等研究發(fā)現(xiàn)鋁過負(fù)荷可致小鼠腦組織Cu-ZnSOD活性先升高后下降，并認(rèn)為鋁過負(fù)荷引起腦氧化應(yīng)激反應(yīng)，抗氧化應(yīng)激物質(zhì)如Cu-ZnSOD表達(dá)增加，但是SOD基因長期受到自由基攻擊而出現(xiàn)突變，造成抗氧化應(yīng)激的酶功能下降，最終導(dǎo)致機體抗氧化應(yīng)激系統(tǒng)失衡，加重?fù)p傷。

與上述研究結(jié)果相似，筆者的研究發(fā)現(xiàn)與空白對照組相比，模型組海馬組織中金屬離子鋁、鐵、銅、鋅水平明顯增加;給予美洛昔康在阻遏鋁過負(fù)荷大鼠腦組織金屬離子水平的增加。關(guān)于美洛昔康阻遏金屬離子含量增加的機制，目前尚未完全揭示，有研究發(fā)現(xiàn)，前列腺素以及白三烯可促進血腦屏障的開放，從而加重腦缺血損傷〔9〕，通過筆者前期研究發(fā)現(xiàn)神經(jīng)元退變能夠明顯誘導(dǎo)大鼠海馬COX-2 mRNA和蛋白表達(dá)增加〔10〕，增加前列腺素的產(chǎn)生，從而開放血腦屏障，大量金屬離子進入腦內(nèi)，使得腦內(nèi)金屬離子含量明顯增加;而美洛昔康作為COX-2選擇性抑制劑，能夠抑制COX-2 mRNA和蛋白表達(dá)，減少前列腺素的產(chǎn)生，重新關(guān)閉血腦屏障，因而使得進入腦內(nèi)的金屬離子含量明顯降低。筆者的研究還發(fā)現(xiàn)，在腦內(nèi)鐵、鋁離子含量明顯高于其他金屬離子，而以鐵離子含量最高，這可能由于造模本身灌胃給予大量鋁離子，使得大量鋁離子在腦組織沉積，而鋁通過影響鐵調(diào)節(jié)蛋白2使細(xì)胞鐵蛋白表達(dá)明顯降低，最后致使鐵水平顯著升高〔11〕。

總之，美洛昔康對慢性鋁過負(fù)荷致神經(jīng)元退變大鼠腦內(nèi)金屬離子含量升高有明顯的抑制作用。

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