楊樹林 楊 帆 翟 靜 劉金同 張 燕 陳 剛

孤獨癥(autism)是兒童廣泛性發(fā)育障礙(pervasive developmental disorder，PDD)的一種類型，以三主征為主要表現(xiàn)，即言語發(fā)育障礙、人際交往障礙、興趣狹窄和行為方式刻板。發(fā)病后患者的社會能力將受到嚴重影響，有較高的致殘率，給社會和患者家庭帶來沉重負擔。近年的流行病學研究顯示，孤獨癥的患病率比以往有明顯增加，美國為4/10 000～10/10 000、歐洲為10/10 000、中國2.8/10 000 ～11/10 000，男女比例為(4 ～10)∶1［1，2］。本研究以山東省 38 個孤獨癥核心家系及正常對照者為研究對象，使用覆蓋4號染色體的22個微衛(wèi)星遺傳位點進行了基因組掃描，并通過關(guān)聯(lián)分析尋找孤獨癥的相關(guān)性位點。

1 對象和方法

1.1 對象 以國際疾病分類10版(ICD-10)為診斷標準，選擇就診于山東省精神衛(wèi)生中心的孤獨癥核心家系，包括:患者38例，其中女性患者2例，男性患者36例，年齡為2～10歲，平均年齡(5.10±1.61)歲;患者父母75名，其中女性38名，男性37名;1 000名正常對照選自山東省血液中心的健康獻血者，女性570名，男性430名，年齡為 18～53歲，平均年齡(22.2±4.45)歲。本研究得到了山東省醫(yī)學科學院基礎(chǔ)醫(yī)學研究所倫理委員會的批準，對受試者均進行了知情告知。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA制備 采用酚-氯仿法提取外周血樣本中的基因組DNA。采用nanodrop 1000微量光度計測量DNA濃度，每個樣本測量兩次，取平均值。用無菌去離子水將樣品稀釋至20 ng/μl。

1.2.2 DNA混合池(DNA pooling)的構(gòu)建 每組每個樣品取10 μl DNA溶液混合，分別構(gòu)建患者組、對照組和患者父母組的DNA混合池?；旌铣谼NA終濃度為20 ng/μl。

1.2.3 遺傳位點的選擇 選擇針對4號染色體的Linkage Mapping Set2.5 套裝試劑盒(Applied Biosystem，美國)，共22個微衛(wèi)星位點。引物的標記熒光分別為綠色、藍色和黃色，分子量標記熒光為橙色。

1.2.4 PCR反應(yīng) 使用Gene Amp 9700 DNA擴增儀(Applied Biosystem，美國)進行PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)體系總體積為 15 μl，包括:DNA 模板 1.5 μl(20 ng/μl)，PrimeSTAR HS Premix(Takara)7.5 μl，等量正反向引物混合液 1 μl(5 μM)，無菌去離子水 5 μl。反應(yīng)程序為降落式PCR(Touch Down PCR):94℃變性90 s，63℃退火90 s(每循環(huán)一次，退火溫度降低0.5℃)，72 ℃延伸90 s，14個循環(huán);94 ℃變性30 s，56℃退火90 s，72℃ 延伸90 s，30個循環(huán);72℃延伸7 min;4℃保存。

1.2.5 毛細管凝膠電泳及基因分型 按照PCR產(chǎn)物熒光顏色和片段大小的不同，將PCR產(chǎn)物搭配組合進行電泳觀察。患者組、對照組和患者父母組分別上樣，取混合后的 PCR 產(chǎn)物 4 μl與 9 μl上樣液(0.15 μl Liz 500，9 μl去離子甲酰胺)混合 ，加入96孔板中。95℃變性5 min，并迅速冰浴冷卻。使用ABI-3130(Applied Biosystem，美國)毛細管電泳儀進行電泳觀察。試驗數(shù)據(jù)由GeneMapper4.0軟件(Applied Biosystem，美國)進行分析。

1.3 統(tǒng)計學處理 樣品經(jīng)過PCR擴增和基因分型后，即可得到等位基因圖譜(allele image pattern，AIP)。圖譜中峰的數(shù)量為遺傳位點上的等位基因數(shù)量，峰高則代表對應(yīng)等位基因的染色體數(shù)量。每個混合池中染色體的數(shù)量并不相等，相同位點兩組間的信號強度不可直接比較。所以，首先算出各等位基因占所有等位基因的比率，再乘以總?cè)旧w數(shù)，即可得到該等位基因在相應(yīng)實驗組中的染色體數(shù)量。以對照組為例，人類為二倍體核型，1 000例對照組樣本在常染色體上的遺傳位點由2 000個等位基因組成，將某個等位基因的比率乘以2 000即可得到相應(yīng)等位基因在混合池中的染色體數(shù)量?；颊呓M與患者父母組使用相同方法計算。采用CLUMP軟件對患者組和對照組、患者組和患者父母組每個位點上的等位基因頻率進行比較。兩組間基因頻率差異以P＜0.01作為有顯著性的標準。

2 結(jié)果

最終得到3個混合池樣本4號染色體上22個微衛(wèi)星位點的等位基因圖譜。根據(jù)圖譜計算各組位點中等位基因的染色體數(shù)量，采用CLUMP軟件統(tǒng)計比較各組間等位基因頻率的差異(見表1)。發(fā)現(xiàn)患者組與患者父母組的等位基因頻率在D4S392(4q13.3)位點有顯著性差異(P＜0.01);患者組與對照組的等位基因頻率在D4S1535(4q35.1)位點有顯著性差異(P＜0.01)。進行3次重復實驗，結(jié)果得到一致性驗證，確認此位點與孤獨癥呈現(xiàn)關(guān)聯(lián)。與孤獨癥相關(guān)聯(lián)的D4S392(4q13.3)位點和 D4S1535(4q35.1)位點的等位基因圖譜見圖1和圖2。

表1 孤獨癥患者組、患者父母組與對照組的4號染色體微衛(wèi)星位點掃描關(guān)聯(lián)分析結(jié)果

圖1 孤獨癥患者組、患者父母組與對照組的D4S392位點基因掃描圖

圖2 孤獨癥患者組、患者父母組與對照組的D4S1535位點基因掃描圖

3 討論

孤獨癥屬于多基因遺傳病，有較高的遺傳異質(zhì)性，遺傳因素在孤獨癥的發(fā)病過程中發(fā)揮了重要作用，其遺傳度約為91%［2，3］。關(guān)聯(lián)與連鎖分析被較多地用于孤獨癥易感基因的研究。孤獨癥的分子遺傳學研究中也常以孤獨癥譜系疾病(autism spectrum disorder，ASD)和廣義孤獨癥(broad autism phenotype)作為研究對象。近20年來，國際上陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了一些孤獨癥遺傳位點。其中已確定與孤獨癥連鎖的遺傳位點和基因有24個，分別是 7q22(AUTS1)、13q14(AUTS3)、15q11(AUTS4)、2q(AUTS5)、17q11(AUTS6)、17q21(AUTS7)、3q25-q27(AUTS8)、7q31(AUTS9)、7q36(AUTS10)、1q41(AUTS11)、21p13-q11(AUTS12)、12q14(AUTS13)、16p11.2(AUTS14A 、AUTS14B)、CNTNAP2基因(AUTS15)、SLC9A9基因(AUTS16)、SHANK2基因 (AUTS17)、CHD8 基因 (AUTS18)、NLGN3基因(AUTSX1)、NLGN4 基因(AUTSX2)、MECP2 基因(AUTSX3)、Xp22.11(AUTSX4)、RPL10基因(AUTSX5)和TMLHE基因(AUTSX6)。

迄今，對4號染色體與孤獨癥之間的相關(guān)性也進行了一系列的關(guān)聯(lián)與連鎖分析。Schellenberg等［4］以微衛(wèi)星為遺傳學標記對孤獨癥患者進行了全基因組掃描研究，通過連鎖不平衡分析，在有女性患者的家系中發(fā)現(xiàn)4號染色體上存在易感位點。Field等［5］在對有閱讀障礙患者家系的關(guān)聯(lián)分析中發(fā)現(xiàn)4q13.1、7q36.1-q36.2、7q36.3、16p12.1 和17q22 五個位點的 lod 值大于2.3，與疾病存在關(guān)聯(lián)。其中4q13.1位點與兒童多動癥存在關(guān)聯(lián)，7q36.1-q36.2、7q36.3、16p12.1 和17q22位點與孤獨癥存在關(guān)聯(lián)。Zuo等［6］發(fā)現(xiàn)4號染色體上的ADH基因是非洲裔美國人精神分裂癥和歐洲裔美國人孤獨癥的危險因素。但是，Auranen等［7］對芬蘭隔離人群中的孤獨癥復雜家系進行了配對連鎖分析和同胞對分析中并未發(fā)現(xiàn)4號染色體上存在孤獨癥的易感性位點。

核型分析是遺傳性疾病病因研究的重要方法。人們發(fā)現(xiàn)染色體的異位、倒位、缺失和重迭在孤獨癥的發(fā)生過程中發(fā)揮了重要作用，同時也是尋找孤獨癥易感基因的重要途徑。Sabaratnam M等［8］報道了一例有dup(4)p12-p13染色體畸變的18歲女性孤獨癥患者。Ramanathan S等［9］報道了一例有 46，XY del 4(q31.3-q33)染色體畸變的孤獨癥患者，他們又通過分子遺傳學的研究方法發(fā)現(xiàn)該患者存在AMPA2基因，GLRA3基因，GLRB基因，NPY1R基因和NPY5R基因的半合子狀態(tài)，這些基因在學習、記憶能力和某些神經(jīng)遞質(zhì)的表達中起到重要作用。Vincent JB等［10］報道了兩個有46，XY，inv(4)(p12-p15.3)染色體畸變的孤獨癥同胞，這個畸變可能影響到了γ-氨基丁酸受體基因家族，并由此引發(fā)孤獨癥。為了驗證γ-氨基丁酸系統(tǒng)對孤獨癥的影響，Collins AL等［11］以高加索人種和非洲裔美國人種的孤獨癥復雜家系進行了研究，通過對35個SNP位點的篩查，他們發(fā)現(xiàn)這兩個人種在GABRB1基因和GABRA4基因中均存在陽性位點。Chien WH 等［12］報道了兩個在 4q35.1-35.2 區(qū)域和8p23.2-pter分別存在 6.8 Mb 和 2.4 Mb 缺失的男性孤獨癥患者，而且這種染色體畸變在其他患者和正常對照人群中均未被發(fā)現(xiàn)。Shimada S等［13］報道了一例有智力障礙和孤獨癥癥狀的塞-科二氏綜合征的患者，通過染色體表型分析，發(fā)現(xiàn)該患者在4q13.2和7p21.1區(qū)域同時存在缺失。與同樣存在7p21.1區(qū)域缺失的此類患者相比，該患者的精神癥狀較重，所以4q13.2區(qū)域的缺失可能是導致這一現(xiàn)象的原因。

此外，其他研究方法也表明4號染色體上存在孤獨癥的易感位點。三堿基重復序列在人類DNA中廣泛存在，如CCG等，研究表明這些重復序列的變化可以影響某些疾病的遺傳易感性，如雙向情感障礙、精神分裂癥、孤獨癥和焦慮癥。Kleiderlein JJ等［14］通過cDNA探針發(fā)現(xiàn)4q35區(qū)域就存在這種重復序列。在DNA拷貝數(shù)變異(copy number variants，CNVs)的研究中，Gau SS等［15］報道了一例孤獨癥患者在 4q12-13.1和5q32區(qū)域存在分別為4.5 Mb和1.8 Mb的CNVs，這兩處變異分別來自無任何孤獨癥癥狀的患者母親和父親，所以可能是這兩處變異的綜合效應(yīng)導致了孤獨癥的發(fā)生。

在之前的研究中，我們發(fā)現(xiàn)患者組與對照組的等位基因頻率在D7S513(7p21.3)位點有顯著性差異(P＜0.01)［16］。此次對4 號染色體的研究中，我們發(fā)現(xiàn)患者組與患者父母組的等位基因頻率在D4S392位點(4q13.3)有顯著性差異(P ＜0.01);患者組與對照組的等位基因頻率在D4S1535位點(4q35.1)有顯著性差異(P＜0.01)。這兩個位點與孤獨癥的相關(guān)性在我國也是首次報道。我們計劃在 D4S392和D4S1535附近挑選基因，選擇SNP等高密度遺傳標記，通過關(guān)聯(lián)分析、構(gòu)建單倍體型等方法，進一步篩選孤獨癥的易感基因。

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