孫欣欣，王紅兵，徐海洋

(1.徐州醫(yī)學(xué)院研究生學(xué)院，江蘇 徐州221002;2.徐州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，江蘇 徐州221002)

乳腺癌易感基因1(breast cancer susceptibility gene 1，BRCA1)是一個(gè)抑癌基因，參與基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、細(xì)胞周期調(diào)控、DNA 雙鏈損傷修復(fù)、細(xì)胞凋亡和泛素化等重要的細(xì)胞活動(dòng)，其中DNA 雙鏈修復(fù)途徑主要包括:同源重組修復(fù)、非同源末端連接［1-3］。胃癌是常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)生、發(fā)展與癌基因的激活、抑癌基因的失活等因素有關(guān)，而基因啟動(dòng)子CpG 島甲基化是抑癌基因失活的一重要途徑［4］。抑癌基因啟動(dòng)子CpG 島異常甲基化常常導(dǎo)致其轉(zhuǎn)錄異常、表達(dá)下調(diào)甚至缺失，進(jìn)而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生［5］。DNA 甲基化在腫瘤基因表達(dá)調(diào)控、分化發(fā)育、細(xì)胞增殖等方面起著重要作用，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，因此成為當(dāng)前分子學(xué)研究熱點(diǎn)之一。目前國內(nèi)關(guān)于BRCA1 基因甲基化與BRCA1 mRNA 表達(dá)相關(guān)性在腫瘤中研究甚少，而在胃癌組織中尚無文獻(xiàn)報(bào)道。本研究采用甲基化特異性PCR 技術(shù)檢測(cè)37 例胃癌組織和對(duì)應(yīng)癌旁組織及6 例正常胃組織中BRCA1 基因啟動(dòng)子CpG 島甲基化狀態(tài);采用逆轉(zhuǎn)錄PCR 技術(shù)檢測(cè)37 例胃癌組織和對(duì)應(yīng)癌旁組織及6 例正常胃組織中BRCA1 mRNA 表達(dá)水平，探討B(tài)RCA1 基因啟動(dòng)子CpG 島甲基化與BRCA1 mRNA 表達(dá)的相關(guān)性及其意義。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 收集2013年6月至2013年12月徐州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院經(jīng)病理診斷證實(shí)的胃癌組織37 例，同時(shí)取其對(duì)應(yīng)癌旁組織，另取6 例胃部良性病變旁正常胃組織作為對(duì)照組。所有胃癌患者術(shù)前均未接受過放化療，癌旁組織距離癌組織5 cm 以上。37 例患者中，男29 例，女8 例，年齡31 ～80 歲，中位年齡63 歲。所有標(biāo)本均于術(shù)后30 min 內(nèi)獲得，液氮速凍后-80 ℃冰箱保存。

1.2 主要試劑 基因組DNA 提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄PCR 相關(guān)試劑盒購自北京天根生化科技有限公司，EZ DNA methylation-Gold、Hot start Taq DNA 聚合酶購自美國Zymo Research 公司，TRIzol 試劑購自美國ABI 公司，引物由上海生工合成。

1.3 方法

1.3.1 組織DNA 提取和甲基化修飾 每個(gè)樣本取30 mg 左右組織塊進(jìn)行勻漿處理，參照組織基因組DNA 提取試劑盒說明書提取基因組DNA，UV3000 紫外分光光度儀測(cè)定DNA 濃度和純度，OD260/OD280比值在1.8 ～2.0 之間的DNA 用于甲基化修飾。各樣本DNA 取1.5 μg，參照EZ DNA 甲基化試劑盒說明書進(jìn)行甲基化修飾，修飾好的DNA 洗脫后于-20 ℃保存。

1.3.2 甲基化特異性PCR 法 甲基化引物:M，F(xiàn):5'-TCGTGGTAACGGAAAAGCGC-3'，R:5'- AAATCTCAACGAACTCACGCCG-3'。非甲基化引物:U，F(xiàn):5'-TTGGTTTTTGTGGTAATGGAAAAGTGT-3'，R:5'-CAAAAAATCTCAACAAACTCACACCA-3'。PCR 反應(yīng)體系:PCR 混合液(美國Zymo Research 公 司)12.5 μL，上 下 游 引 物(10 μmol·L-1)各1.0 μL，修飾好的模板2 μL，加無核酶水補(bǔ)足至25 μL。循環(huán)條件:95 ℃預(yù)變性10 min，然后進(jìn)行40 個(gè)循環(huán)擴(kuò)增:95 ℃變性30 s，甲基化引物及非甲基化引物分別在60 ℃、58 ℃退火55 s，72 ℃延伸30 s，最后于72 ℃延伸7 min。甲基化特異性引物(M)擴(kuò)增的目的片段為75 bp，非甲基化特異性引物(U)擴(kuò)增的目的片段為86 bp。取10 μL PCR 產(chǎn)物在3%瓊脂糖凝膠上電泳，以TIANGEN 50 bp DNA Lad-der(MD108-01)為標(biāo)準(zhǔn)DNA Marker 同步電泳，EB 染色后凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果并記錄。判斷標(biāo)準(zhǔn)［6］:M陽性、U 陰性為完全甲基化;M 陽性、U 陽性為部分甲基化;M 陰性、U 陽性為非甲基化。

1.3.3 RNA 提取及逆轉(zhuǎn)錄PCR 檢測(cè)mRNA 每個(gè)樣本取約100 mg 組織，采用Trizol 試劑(按照說明書操作)提取組織總RNA，紫外分光光度計(jì)檢測(cè)其濃度、純度，取總RNA 1 μg，按照逆轉(zhuǎn)錄說明書合成cDNA。普通PCR 擴(kuò)增BRCA1 基因，引物如下:F:5'-TTGCGGGAGGAAAATGGGTAGTTA-3'，R:5'-TGTGCCAAGGGTGAATGATGAAAG-3'，擴(kuò)增的目的片段為292 bp，內(nèi)參照選用β-actin，F(xiàn):5'-AAATCTGGCACCACACCTTC-3'，R:5'-CCATCTCTTGCTCGAAGTCC-3'，擴(kuò)增的目的片段為432 bp。PCR 為25 μL 體系:2 ×Taq PCR Master-Mix(北京天根生化科技有限公司)12.5 μL，上下游引物(10 μmol·L-1)各1.0 μL，模板cDNA 2 μL，加水至25 μL，95 ℃預(yù)變性2 min，然后進(jìn)行35 個(gè)循環(huán)擴(kuò)增:95 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，最后于72 ℃延伸5 min。2%瓊脂糖凝膠電泳，電泳結(jié)果在紫外燈下觀察。根據(jù)以下標(biāo)準(zhǔn)判斷結(jié)果:432 bp 處出現(xiàn)條帶，同時(shí)292 bp 處出現(xiàn)條帶即可判斷該標(biāo)本BRCA1 mRNA 表達(dá)陽性;僅432 bp 處出現(xiàn)條帶則判斷為BRCA1 mRNA 表達(dá)陰性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 16.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，BRCA1 基因甲基化、BRCA1 mRNA 表達(dá)結(jié)果比較采用χ2檢驗(yàn);BRCA1 基因甲基化與BRCA1 mRNA 表達(dá)之間的關(guān)系分析采用確切概率法及定性資料相關(guān)分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 不同胃組織中BRCA1 基因啟動(dòng)子CpG 島甲基化狀態(tài) 37 例胃癌組織中有18 例甲基化，其中6 例為完全甲基化，12 例為部分甲基化，總甲基化率為48.6%(18/37);對(duì)應(yīng)37 例癌旁組織中2 例部分甲基化，總甲基化率為5.4%(2/37);6 例正常胃組織中均未檢測(cè)到BRCA1 基因甲基化，總甲基化率為0. 0%(0/6)。胃癌組織中BRCA1 基因啟動(dòng)子CpG 島甲基化率顯著高于癌旁組織及正常胃組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=17.541、5.021，P 均＜0.05)。見圖1。

2.2 不同胃組織中BRCA1 mRNA 表達(dá) 37 例胃癌組織中，陽性表達(dá)18 例，陽性表達(dá)率為48. 6%(18/37);對(duì)應(yīng)37 例癌旁組織中，陽性表達(dá)35 例，陽性表達(dá)率為94.6%(35/37)，6 例正常胃組織中均陽性表達(dá)，陽性表達(dá)率100. 0% (6/6)。胃癌組織中BRCA1 mRNA 陽性表達(dá)率顯著低于癌旁組織和正常胃組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=19.215、5.520，P 均＜0.05)。見圖2。

圖1 不同胃組織中BRCA1 基因啟動(dòng)子CpG 島甲基化檢測(cè)結(jié)果

圖2 不同胃組織中BRCA1 mRNA 表達(dá)情況

2.3 BRCA1 基因啟動(dòng)子CpG 島甲基化與BRCA1 mRNA 表達(dá)的關(guān)系 18 例BRCA1 基因啟動(dòng)子CpG島甲基化的胃癌組織中有4 例BRCA1 mRNA 表達(dá)陽性，19 例BRCA1 基因啟動(dòng)子CpG 島非甲基化的胃癌組織中有14 例BRCA1 mRNA 表達(dá)陽性，胃癌組織中發(fā)生BRCA1 基因啟動(dòng)子CpG 島甲基化的BRCA1 mRNA 陽性表達(dá)率顯著低于未發(fā)生甲基化的胃癌組織(χ2=9. 799，P ＜0. 05)，BRCA1 基因甲基化與BRCA1 mRNA 表達(dá)成負(fù)相關(guān)(r= -0.515，P ＜0.05)。

3 討論

BRCA1 基因是與家族性乳腺癌和卵巢癌相關(guān)的基因，定位于人染色體17q21，基因組DNA 長約100 kb，具有24 個(gè)外顯子，其中22 個(gè)外顯子轉(zhuǎn)錄7.6 kb mRNA，最終編碼一個(gè)由1 863 個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)，其相對(duì)分子質(zhì)量為220 000［7］。表觀遺傳學(xué)首先提出基因的DNA 序列沒有發(fā)生改變，而基因功能發(fā)生可遺傳的變異，并最終導(dǎo)致表型的改變，主要包括X 染色體失活、DNA 甲基化、組蛋白修飾、非編碼RNA 調(diào)控等［8］。DNA 甲基化是表觀遺傳學(xué)研究最深入的內(nèi)容之一［9］，指生物體在DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶的催化下，以S-腺苷甲硫氨酸為甲基供體，將甲基轉(zhuǎn)移到特定的堿基上的過程。甲基化主要發(fā)生在啟動(dòng)子CpG 島5'端胞嘧啶堿基，這些位點(diǎn)在正常情況下處于完全非甲基化狀態(tài)，CpG 島發(fā)生甲基化往往會(huì)導(dǎo)致基因的轉(zhuǎn)錄失活或沉默［10］。近年來研究［11］表明，抑癌基因的啟動(dòng)子CpG 島異常甲基化導(dǎo)致其功能失活是腫瘤發(fā)生的重要機(jī)制之一。研究［12］也已證實(shí)啟動(dòng)子CpG 島異常甲基化以及腫瘤相關(guān)基因的沉默是胃癌發(fā)生的重要機(jī)制，p16、APC 等基因甲基化在胃癌中已被研究。

本研究采用甲基化特異性PCR 技術(shù)檢測(cè)37 例胃癌組織和對(duì)應(yīng)癌旁組織及6 例正常胃組織中BRCA1基因啟動(dòng)子CpG 島甲基化狀態(tài)，結(jié)果顯示胃癌組織中總甲基化率為48.65%，顯著高于癌旁組織的5.4%和正常胃組織的0.0%。本研究結(jié)果提示胃癌組織中存在高比例的BRCA1 基因啟動(dòng)子CpG 島甲基化，說明BRCA1 基因啟動(dòng)子CpG 島甲基化可能參與了胃癌的發(fā)生、發(fā)展。本研究在2 例癌旁組織中也檢測(cè)到BRCA1 基因啟動(dòng)子CpG 島甲基化，且對(duì)應(yīng)癌組織中均存在該基因完全甲基化，癌旁組織中存在BRCA1 基因啟動(dòng)子CpG 島甲基化，這一現(xiàn)象可能預(yù)示癌旁組織已經(jīng)處于癌前病變階段。采用逆轉(zhuǎn)錄PCR 檢測(cè)37 例胃癌組織和對(duì)應(yīng)癌旁組織及6 例正常胃組織中BRCA1 mRNA 表達(dá)水平，結(jié)果顯示，BRCA1 mRNA 的陽性表達(dá)率在胃癌組織中為48.6%，明顯低于對(duì)應(yīng)癌旁組織的94. 6% 和正常胃組織的100. 0%。為了證實(shí)BRCA1 基因啟動(dòng)子CpG 島甲基化狀態(tài)與BRCA1 mRNA 表達(dá)之間的關(guān)系，我們對(duì)胃癌組織中甲基化組和非甲基化組BRCA1 mRNA 表達(dá)的差異進(jìn)行分析，結(jié)果顯示:18 例BRCA1 基因啟動(dòng)子CpG 島甲基化的胃癌組織中有4 例BRCA1 mRNA 表達(dá)陽性，19 例BRCA1基因啟動(dòng)子CpG 島非甲基化的胃癌組織中有14 例BRCA1 mRNA 表達(dá)陽性，而且BRCA1 基因啟動(dòng)子CpG 島甲基化與BRCA1 mRNA 表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)(r= -0.515，P ＜0.05)，提示BRCA1 基因啟動(dòng)子CpG島甲基化是導(dǎo)致BRCA1 基因失表達(dá)的原因之一。

綜上所述，我們初步證實(shí)了胃癌組織中存在高比例的BRCA1 基因啟動(dòng)子CpG 島甲基化，BRCA1 基因啟動(dòng)子CpG 島甲基化可能是導(dǎo)致BRCA1 mRNA 失表達(dá)的主要原因之一，BRCA1 基因啟動(dòng)子CpG 島甲基化與胃癌的發(fā)生、發(fā)展有一定關(guān)系。由于DNA 甲基化是可逆的基因修飾過程，通過逆轉(zhuǎn)抑癌基因的甲基化狀態(tài)，恢復(fù)細(xì)胞正常生長的調(diào)節(jié)功能，可能成為胃癌治療的新靶點(diǎn)。

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