周云 曹先偉 許桂文 吳紅宣 郭竹秀 陳麗

家族性原發(fā)性皮膚淀粉樣變一家系的OSMR基因突變檢測(cè)

周云 曹先偉 許桂文 吳紅宣 郭竹秀 陳麗

目的檢測(cè)家族性原發(fā)性皮膚淀粉樣變一家系患者的OSMR基因突變情況。方法收集一家族性皮膚淀粉樣變家系臨床資料,提取先證者及其19名相關(guān)親屬、50例無(wú)關(guān)健康對(duì)照外周血DNA,采用PCR擴(kuò)增OSMR基因編碼區(qū)的全部外顯子及其側(cè)翼序列并測(cè)序。結(jié)果基因檢測(cè)發(fā)現(xiàn),先證者OSMR基因發(fā)生c.2081C＞T雜合突變,導(dǎo)致氨基酸出現(xiàn)p.P694L改變,家族中其他患者均發(fā)現(xiàn)同樣突變位點(diǎn),而家族健康成員及健康對(duì)照組均未檢出此突變。結(jié)論OSMR基因的p.P694L突變可能是導(dǎo)致患者出現(xiàn)皮膚淀粉樣變臨床表型的病因。

淀粉樣變,家族性;OSMR基因;突變,誤義

皮膚淀粉樣變(PCA)是一種慢性瘙癢性皮膚病,大多數(shù)為散發(fā)病例,約10%有顯性遺傳家族史［1］。家族性原發(fā)性皮膚淀粉樣變(FPCA,OMIM 105250)一般在青春期前后起病,通常表現(xiàn)為脛前瘙癢,可見(jiàn)色素沉著及皮膚增厚或苔蘚樣變,可逐漸向身體其他部位蔓延,皮損可因慢性搔抓和摩擦等慢性損傷而加重。目前認(rèn)為FPCA的發(fā)病為第5號(hào)染色體上編碼細(xì)胞因子制瘤素M 特異性受體 β(oncostatin M-specific receptor β,OSMRβ)的基因OSMR突變所致［1］。我們對(duì)一個(gè)FPCA家系進(jìn)行OSMR基因突變檢測(cè)。

一、檢測(cè)對(duì)象

先證者(Ⅲ13)男,46歲,18歲時(shí)雙脛前對(duì)稱(chēng)散在米粒大小褐色斑丘疹,后逐漸形成隆起的丘疹,伴有明顯瘙癢感。丘疹逐漸增大并增多,針頭至米粒大小,呈多角形或不規(guī)則形,棕褐色,密集成片但不融合,周邊可見(jiàn)少許褐色斑疹。皮損處皮膚較干燥且粗糙,表面可見(jiàn)少許鱗屑,有較多黑色角栓,伴有抓痕和血痂。家族中其他受累成員發(fā)病年齡為5～25歲(圖1),主要表現(xiàn)為皮膚苔蘚樣變,亦可見(jiàn)斑狀皮損。典型表現(xiàn)為開(kāi)始于小腿的少量輕度苔蘚樣變丘疹伴輕微色素沉著,家系中大部分患者逐漸發(fā)展為局限于小腿的不同程度的以苔蘚樣變?yōu)橹鞯钠p,并伴有不同程度的瘙癢(圖2a)。對(duì)照組50例為與此家系無(wú)血緣關(guān)系且無(wú)皮膚淀粉樣變的健康人。

圖1 原發(fā)性皮膚淀粉樣變家圖 *:采血并做了基因檢測(cè)

二、方法

1.組織病理學(xué)檢查:取先證者脛前丘疹性皮損行HE染色和剛果紅染色。

2.DNA提取:分別抽取先證者、19例家庭成員及50例健康對(duì)照外周血2 ml,2%乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝,以低滲溶血以及酚-氯仿抽提法提取DNA。

3.PCR引物設(shè)計(jì):根據(jù)OSMR基因序列(來(lái)源于http://www.ensembl.org/index.html),利用 Primer3在線(xiàn)版(http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/)設(shè)計(jì)18對(duì)特異性引物擴(kuò)增先證者OSMR基因編碼區(qū)18個(gè)外顯子及其側(cè)翼序列,引物由北京天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司合成。

圖2 原發(fā)性皮膚淀粉樣變的臨床及病理特征 2a:患者脛前多角形丘疹,棕褐色,密集成片但不融合,表面可見(jiàn)少許鱗屑、皮膚粗糙干燥,頂端多見(jiàn)黑色角栓;2b:剛果紅染色顯示真皮乳頭層無(wú)定形的陽(yáng)性團(tuán)塊(×40)

圖3 原發(fā)性皮膚淀粉樣變患者基因測(cè)序結(jié)果 3a:先證者c.2081C＞T雜合突變測(cè)序圖,家族中其他患者測(cè)序結(jié)果與先證者相同;3b:家系中未受累成員及50例健康對(duì)照的該位點(diǎn)測(cè)序圖

4.PCR反應(yīng)體系及條件:PCR反應(yīng)體系25 μl,含基因組DNA 50 ng,dNTPs 0.4 mmol/L,MgCl22.0 mmol/L,上下游引物各10 μmol/L,Taq DNA聚合酶2.5 U。反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性5 min后,進(jìn)行以下10個(gè)循環(huán):94℃變性30 s,62℃退火30 s(每個(gè)循環(huán)后退火溫度降低0.5℃),72℃延伸45 s,接著進(jìn)行35個(gè)循環(huán):94℃變性30 s,57℃退火30 s,72℃延伸45 s,共45個(gè)循環(huán),最后72℃延伸9 min,DNA擴(kuò)增在Eppendorf Mastercycler Gradient PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行。所有PCR產(chǎn)物純化后送至北京天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司測(cè)序。

三、結(jié)果

HE染色示表皮輕度角化過(guò)度,棘層肥厚,真皮乳頭層內(nèi)見(jiàn)大小不一的團(tuán)塊狀嗜伊紅性淀粉樣物質(zhì)沉積,剛果紅染色陽(yáng)性(圖2b)。以先證者基因組DNA為模板,所有18對(duì)引物在各自的條件下分別擴(kuò)增出各自產(chǎn)物,包括所有外顯子的編碼序列以及兩端至少60 bp的側(cè)翼序列。所有產(chǎn)物純化后測(cè)序結(jié)果與Ensembl網(wǎng)站所公布的序列進(jìn)行對(duì)照發(fā)現(xiàn),先證者OSMR基因15號(hào)外顯子第2 081位核苷酸(從cDNA編碼起始位點(diǎn)ATG算起)發(fā)生C→T雜合錯(cuò)義突變(c.2081C＞T),見(jiàn)圖3a。導(dǎo)致第694號(hào)編碼氨基酸發(fā)生脯氨酸到亮氨酸(p.P694L)改變,突變來(lái)自母親。先證者母親及其他受累親屬均發(fā)生同樣突變,而未受累成員及50例健康對(duì)照均未見(jiàn)該突變(圖3b)。

四、討論

FPCA是一種常染色體顯性遺傳性皮膚病。2006 年,Lee 等［2］應(yīng)用全基因組掃描等方法將FPCA的致病基因定位于 5p13.1-q11.2。 2008 年,Arita 等［1］應(yīng)用微衛(wèi)星連鎖分析法確定本病的致病基因?yàn)镺SMR。OSMR基因編碼的跨膜蛋白OSMRβ是制瘤素M Ⅱ型受體［3］和白介素31受體［4］的重要組成部分,OSMRβ和gp130結(jié)合組成制瘤素MⅡ型受體,OSMRβ與IL31RA結(jié)合組成白介素31受體,這兩種受體均屬于IL-6細(xì)胞因子受體家族成員［3］。位于OSMRβ分子上的Ⅲ型纖連蛋白(FNⅢ)結(jié)構(gòu)對(duì)OSMRβ與其相應(yīng)受體亞單位的二聚化過(guò)程起到重要的作用［5］。本研究報(bào)道的突變氨基酸p.P694L位于 OSMRβ 分子上的 FNⅢ重復(fù)區(qū)域［6］。 Lin 等［6］通過(guò)對(duì) 29 個(gè)FPCA家系的基因研究發(fā)現(xiàn),其中一個(gè)家系的IL31RA基因發(fā)生雜合錯(cuò)義突變(c.1562C＞T),導(dǎo)致氨基酸發(fā)生p.S521F改變,可能也與本病發(fā)生有關(guān)。IL31RA基因也位于5號(hào)染色體,其編碼的IL31RA與OSMRβ結(jié)合形成IL-31受體。Lin等［6］推測(cè)此突變也是通過(guò)影響皮膚相應(yīng)的信號(hào)通路而引起FPCA的發(fā)生。

［1］Arita K，South AP，Hans-Filho G，et al.Oncostatin M receptorbeta mutations underlie familial primary localized cutaneous amyloidosis［J］.Am J Hum Genet，2008，82(1):73-80.

［2］Lee DD，Lin MW，Chen IC，et al.Genome-wide scan identifies a susceptibility locus for familial primary cutaneous amyloidosis on chromosome 5p13.1-q11.2 ［J］.Br J Dermatol，2006，155(6):1201-1208.

［3］Heinrich PC，Behrmann I，Haan S，et al.Principles of interleukin(IL)-6-type cytokine signalling and its regulation［J］.Biochem J，2003，374(Pt 1):1-20.

［4］Hofstra RM，Sijmons RH，Stelwagen T，et al.RET mutation screening in familial cutaneous lichen amyloidosis and in skin amyloidosis associated with multiple endocrine neoplasia［J］.J Invest Dermatol，1996，107(2):215-218.

［5］Kurth I，Horsten U，Pflanz S，et al.Importance of the membraneproximal extracellular domains for activation ofthesignal transducer glycoprotein 130［J］.J Immunol，2000，164(1):273-282.

［6］Lin MW，Lee DD，Liu TT，et al.Novel IL31RA gene mutation and ancestral OSMR mutant allele in familial primary cutaneous amyloidosis［J］.Eur J Hum Genet，2009，18(1):26-32.

Mutation analysis of the OSMR gene in a family with familial primary cutaneous amyloidosis

Zhou Yun*，Cao Xianwei，Xu Guiwen，Wu Hongxuan，Guo Zhuxiu，Chen Li.*Department of Dermatology，F(xiàn)irst Affiliated Hospital of Nanchang University，Nanchang 330006，China

Cao Xianwei，Email:ndyfyygk@163.com

Objective To identify mutations in the OSMR gene in a pedigree with familial primary cutaneous amyloidosis(FPCA).Methods Clinical data were collected from a pedigree with FPCA.Peripheral blood samples were obtained from the proband，his 19 relatives，and 50 unrelated healthy human controls.Genomic DNA was extracted from these blood samples，and subjected to PCR for the amplification of 18 encoding exons and their flanking sequences of the OSMR gene followed by DNA sequencing.Results A heterozygous missense mutation c.2081C ＞ T，which leads to the substitution of proline by threonine at position 694，was detected in the OSMR gene of the proband and his affected relatives，but not in unaffected relatives or healthy controls.Conclusion The heterozygous mutation p.P694L in the OSMR gene may cause the clinical phenotype of FPCA in this family.

Amyloidosis，familial；Gene，OSMR；Mutation，missense

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2014.08.017

330006南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院皮膚科(周云、曹先偉、吳紅宣、郭竹秀、陳麗);青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院皮膚科(許桂文)

曹先偉,Email:ndyfyygk@163.com

2013-07-24)

(本文編輯:尚淑賢)