張璟晶 唐勁松 管遠(yuǎn)紅 王海波

(江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院食品科技學(xué)院，江蘇泰州 225300)

冰鮮銀鯧能夠最大程度地保持魚(yú)肉風(fēng)味和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，但冰鮮水產(chǎn)品也極其容易腐敗變質(zhì)，其主要原因是由微生物引起的［1］。導(dǎo)致冰鮮水產(chǎn)品腐敗的往往是少數(shù)適合生存、繁殖并產(chǎn)生腐敗臭味代謝產(chǎn)物的特定優(yōu)勢(shì)菌群，這些優(yōu)勢(shì)腐敗菌的生長(zhǎng)速度和致腐能力較強(qiáng)，隨著貯藏時(shí)間的增加，其在菌落總數(shù)中的比例不斷增加［2］。因此找出冰鮮水產(chǎn)品的優(yōu)勢(shì)腐敗菌對(duì)于控制該種水產(chǎn)品的腐敗變質(zhì)具有重要意義。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)于水產(chǎn)品中腐敗菌已有研究報(bào)道，例如:藍(lán)蔚青等［3］對(duì)冷藏帶魚(yú)的主要細(xì)菌菌相進(jìn)行了分析;張?chǎng)?］和許振偉［5］等分別對(duì)冰鮮大黃魚(yú)腸腔細(xì)菌類群結(jié)構(gòu)類型和腐敗菌腐敗能力進(jìn)行了分析。目前僅有針對(duì)鯧魚(yú)冷藏期間的微生物多樣性進(jìn)行的一些研究［6］，但對(duì)于鯧魚(yú)中的優(yōu)勢(shì)腐敗菌的分離鑒定及其腐敗能力的分析并未見(jiàn)報(bào)道。

本研究擬對(duì)冰鮮銀鯧中的主要腐敗微生物進(jìn)行分離純化，通過(guò)形態(tài)學(xué)特征、部分生理生化檢驗(yàn)和16S rDNA分析鑒定相結(jié)合的技術(shù)，確定腐敗鯧魚(yú)中的優(yōu)勢(shì)腐敗菌屬，并比較分析其致腐能力的大小，以便有針對(duì)性地對(duì)冰鮮銀鯧的優(yōu)勢(shì)腐敗菌加以控制，為延長(zhǎng)冰鮮銀鯧的保鮮期提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 原料

銀鯧魚(yú):購(gòu)于泰州市農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)。

1.1.2 試劑

平板計(jì)數(shù)培養(yǎng)基:北京陸橋生物技術(shù)有限公司;

革蘭氏染液、芽孢染色液、微生物生理生化微量鑒定管:青島海博生物技術(shù)有限公司;

用于PCR擴(kuò)增的全套試劑和擴(kuò)增引物:北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限公司;

乙醇、無(wú)水碳酸鈉、氫氧化鈉等:分析純，上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.1.3 試驗(yàn)設(shè)備

電子天平:EL270型，梅特勒—托多利儀器(上海)有限公司;超凈工作臺(tái):SW-CJ-ZFD型，蘇州凈化設(shè)備有限公司;電熱恒溫培養(yǎng)箱:HPX-9162MBE型，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司;

立式壓力蒸汽滅菌鍋:LDZX-30FA型，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備;

PCR擴(kuò)增儀:PTC-200型，北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限公司;

凝膠成像分析儀:YLN-2000A型，北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 冰鮮銀鯧魚(yú)腐敗菌的分離純化 在無(wú)菌操作環(huán)境下，稱取腐敗魚(yú)肉樣品10 g，放入滅過(guò)菌的研缽中，加入海砂，把魚(yú)肉研碎，加生理鹽水90 mL，然后取1 mL進(jìn)行10倍梯度稀釋，選擇3個(gè)合適的稀釋度傾注平板計(jì)數(shù)培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)48 h后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)［7］。將分離出的典型菌落進(jìn)行平板劃線分離，反復(fù)進(jìn)行以獲得純化的單菌落。依據(jù)菌落特征以及革蘭氏染色、芽孢染色、細(xì)胞形狀與細(xì)胞間的排列方式等特征進(jìn)行初步的分類并計(jì)數(shù)，確定在總數(shù)中占有比例較高的3～4種菌為優(yōu)勢(shì)腐敗菌。

1.2.2 優(yōu)勢(shì)腐敗菌致腐能力的確定 用無(wú)菌水將分離純化的優(yōu)勢(shì)菌株分別制成菌懸液，菌體濃度為105CFU/mL。將冰鮮銀鯧流水沖洗后用酒精進(jìn)行表面擦拭消毒后，分割成20 g左右的魚(yú)肉塊，后置于菌懸液中浸泡10 s后取出，4℃冰箱保存，在第1、3、5、7天進(jìn)行菌落總數(shù)和揮發(fā)性鹽基氮(TVBN)測(cè)定，未接種腐敗菌的鯧魚(yú)肉作對(duì)照［5］。以產(chǎn)量因子(YTVB-N/CFU)作為各種腐敗菌致腐能力的定量指標(biāo)。

式中:

N0、NS——分別表示初始點(diǎn)和腐敗點(diǎn)的菌落總數(shù)，CFU/g;

ITVB-N、STVB-N——分別表示初始點(diǎn)和腐敗點(diǎn)的TVB-N含量，mg/100 g。

菌落總數(shù)和揮發(fā)性鹽基氮的測(cè)定分別依據(jù)按GB 4789.2—2010《食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌落總數(shù)測(cè)定》和 GB/T 5009—2008中《半微量定氮法》的方法進(jìn)行測(cè)定。

1.2.3 優(yōu)勢(shì)腐敗菌的鑒定

(1)常規(guī)生理生化試驗(yàn):參照《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》［8］，對(duì)分離得到的純菌株進(jìn)行生理生化鑒定。

(2)優(yōu)勢(shì)腐敗菌分子生物學(xué)鑒定:挑取培養(yǎng)18～24 h腐敗菌制成菌懸液，10 000 r/min離心10 min，棄上清，加入100 μL ddH2O，制得模板DNA。以通用引物27F:5’-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3’和 1541R:5’-AAG GAG GTG ATC CAC CC-3’進(jìn)行擴(kuò)增。

PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系包括:模板 DNA 2 μL，引物27F 1 μL，引物 1541R 1 μL，Taq PCR Master Mix(2 × )25 μL，ddH2O 補(bǔ)至 50 μL。

PCR擴(kuò)增程序:95℃預(yù)變性5 min，接著30個(gè)循環(huán)(95℃變性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸 1 min，30 s)，最終72℃延伸5 min。取5 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，后將擴(kuò)增產(chǎn)物送北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限公司測(cè)序，并登錄NCBI，與數(shù)據(jù)庫(kù)已知序列進(jìn)行比對(duì)，獲得相似性較高的菌株序列，使用MEGA 5.0軟件，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 冰鮮銀鯧魚(yú)腐敗菌的分離純化

根據(jù)在平板上分離得到菌落的形態(tài)特征(圖1)，結(jié)合革蘭氏染色及芽孢的有無(wú)對(duì)菌落進(jìn)行分組，大致分為8組，分別計(jì)數(shù)，并計(jì)算其占全部菌落的比例，將比例超過(guò)5%的菌落定為優(yōu)勢(shì)腐敗菌。通過(guò)表1可以確定在總數(shù)中占有比例較高的4種菌為優(yōu)勢(shì)腐敗菌，按其比例由大到小順序依次列為1號(hào)、2號(hào)、3號(hào)、4號(hào)菌。對(duì)篩選得到4個(gè)優(yōu)勢(shì)腐敗菌株進(jìn)一步的腐敗特性研究。

2.2 優(yōu)勢(shì)腐敗菌致腐能力的初步分析

2.2.1 優(yōu)勢(shì)腐敗菌接種滅菌魚(yú)肉后菌落總數(shù)和TVB-N的變化 將篩選出的4種腐敗菌進(jìn)行反接致腐試驗(yàn)。將無(wú)菌魚(yú)肉分別浸于105CFU/mL的菌懸液中10 s后取出放于無(wú)菌塑料袋中，4℃冰箱保存，以未接種的魚(yú)肉樣品為對(duì)照。在第1、3、5、7天對(duì)魚(yú)肉進(jìn)行菌落總數(shù)和TVB-N測(cè)定。結(jié)果見(jiàn)圖2、3。

銀鯧魚(yú)死后的腐敗變質(zhì)主要是由于魚(yú)體受到細(xì)菌的污染，細(xì)菌生長(zhǎng)繁殖所導(dǎo)致，因此通過(guò)菌落總數(shù)的測(cè)定可以初步判斷銀鯧魚(yú)的新鮮度和腐敗程度。而揮發(fā)性鹽基氮(TVBN)是指動(dòng)物性食品在細(xì)菌和酶的作用下，在腐敗過(guò)程中蛋白質(zhì)分解而產(chǎn)生氨以及胺類等具有揮發(fā)性的堿性含氮物質(zhì)。此類物質(zhì)含量越高，表明氨基酸被破壞的越多，所以TVB-N是評(píng)價(jià)魚(yú)類肉質(zhì)新鮮度的重要指標(biāo)［9］。

圖1 菌落平板計(jì)數(shù)示意圖Figure 1 The flat schemes of total bacterial count

由圖2可知:在貯藏過(guò)程中，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，各接種腐敗菌的處理組和對(duì)照樣品組的菌落總數(shù)均呈增加趨勢(shì)，各處理組菌數(shù)增加幅度較大，在第5天時(shí)，分別接種1號(hào)、2號(hào)、3號(hào)菌和4號(hào)菌的處理組菌落總數(shù)均超過(guò)7.0［lg(CFU/g)］，說(shuō)明接種的各優(yōu)勢(shì)腐敗菌，在低溫下仍能利用魚(yú)肉中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)迅速生長(zhǎng)繁殖，菌數(shù)明顯增加。但在后期隨著魚(yú)肉中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消耗和代謝產(chǎn)物的積累，菌落總數(shù)的增加趨于平緩。圖3表明，TVB-N值初期增長(zhǎng)緩慢，但在第3天以后迅速增加，在第5天時(shí)接種1號(hào)菌的樣品的TVB-N達(dá)到34.3 mg/100 g，說(shuō)明魚(yú)肉已經(jīng)腐敗。由圖2、3可知，隨著菌數(shù)的增加，優(yōu)勢(shì)腐敗菌生長(zhǎng)而伴隨TVB-N值的增加，說(shuō)明優(yōu)勢(shì)腐敗菌的生長(zhǎng)繁殖是使魚(yú)肉中TVB-N增加的重要原因。

2.2.2 優(yōu)勢(shì)腐敗菌腐敗能力定量分析 參照許振偉［5］，黃林［10］等方法，將腐敗點(diǎn)時(shí)TVB-N的增加量與腐敗菌落總數(shù)增加量的比值作為TVB-N的產(chǎn)量因子(YTVB-N)，定量分析各優(yōu)勢(shì)腐敗菌腐敗能力。結(jié)果見(jiàn)表2。

由表2可知，接種了1號(hào)腐敗菌的魚(yú)肉的YTVB-N明顯高于其他菌株，而4號(hào)菌的致腐能力相對(duì)較弱;4株優(yōu)勢(shì)腐敗菌致腐能力:1號(hào)＞3號(hào)＞2號(hào)＞4號(hào)。

表1 各種腐敗菌菌落特征及比例Table 1 Colonial characteristics and proportion of spoilage bacteria

圖2 各種優(yōu)勢(shì)腐敗菌菌落數(shù)變化Figure 2 Growth curve of dominant spoilage bacteria

圖3 接種各種優(yōu)勢(shì)腐敗菌對(duì)TVB-N的影響Figure 3 Effect of dominant spoilage bacteria on TVB-N value

表2 各種優(yōu)勢(shì)腐敗菌的TVB-N產(chǎn)量因子Table 2 Yield factors of TVB-N of dominant spoilage bacteria

2.3 優(yōu)勢(shì)腐敗菌的鑒定

2.3.1 形態(tài)和生理生化特征 通過(guò)篩選得到的4個(gè)優(yōu)勢(shì)腐敗菌，進(jìn)行形態(tài)特征和部分生理生化特征比較，結(jié)果見(jiàn)表3。

2.3.2 優(yōu)勢(shì)腐敗菌16S rRNA的PCR擴(kuò)增與系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建 由圖4可知，篩選得到的4個(gè)優(yōu)勢(shì)腐敗菌經(jīng)PCR擴(kuò)增后經(jīng)電泳檢測(cè)，均得到了1 500 bp左右的條帶。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送至北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序，得到16S rDNA序列后與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)已有的序列通過(guò)BLAST比對(duì)，選取同源性較高的菌株序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，見(jiàn)圖5。

表3 各種優(yōu)勢(shì)腐敗菌的形態(tài)特征和部分生理生化特征Table 3 Morphological and physiological characteristics of dominant spoilage bacteria

圖4 4個(gè)菌株的16S rDNA PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖譜Figure 4 Electropherogram of PCR amplification products of 16S rDNA genes from four strains

圖5 16S rDNA序列同源性的4株細(xì)菌系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Figure 5 Phylogenetic treeof the four strains based on 16S rDNA sequences

結(jié)合表3、圖4和5可以看出:1號(hào)菌與Pseudomonas fluorescens的親緣關(guān)系最近，2號(hào)菌與Lysinibacillus sphaericus的親緣關(guān)系最近，3號(hào)菌與Shewanella sp的親緣關(guān)系最近，4號(hào)菌與Microbacterium oxydans的親緣關(guān)系最近。有研究［11］表明Pseudomonas fluorescens和Shewanella sp廣泛分布于自然界，水產(chǎn)品攜帶較多，并且在低溫下也能生長(zhǎng)，是冷鏈流通中高水分蛋白食品的主要腐敗菌，在有氧冷藏中，這兩種菌也是很多魚(yú)貝類和甲殼類的特定腐敗菌(SSO)。而Lysinibacillus sphaericus和Microbacterium oxydans也是水產(chǎn)養(yǎng)殖中主要的細(xì)菌，占有絕大多數(shù)比例。在本研究中，鯧魚(yú)優(yōu)勢(shì)腐敗菌的致腐能力較強(qiáng)的為Pseudomonas fluorescens。

3 結(jié)論

本研究通過(guò)對(duì)鯧魚(yú)中腐敗菌進(jìn)行分離純化，結(jié)合菌落形態(tài)、細(xì)胞形態(tài)、生理生化特征和16S rDNA分子鑒定方法，對(duì)生長(zhǎng)速度較快，在菌群中占有比例較高且致腐能力較強(qiáng)的優(yōu)勢(shì)腐敗菌群進(jìn)行了鑒定，4種優(yōu)勢(shì)腐敗菌分別鑒定為Pseudomonas fluorescens，Lysinibacillus sphaericus，Shewanella sp和Microbacterium oxydans。同時(shí)通過(guò)致腐能力的測(cè)定，證實(shí)了在冰鮮鯧魚(yú)的腐敗變質(zhì)中，Pseudomonas fluorescens的致腐能力是最強(qiáng)的。下一步將對(duì)冰鮮銀鯧中主要的腐敗菌群進(jìn)行有針對(duì)性的靶向抑制，以期為延長(zhǎng)冰鮮銀鯧的貨架期提供參考。

當(dāng)然，傳統(tǒng)的微生物分離鑒定方法很難真實(shí)反映微生物污染鯧魚(yú)的多樣性以及種群變化現(xiàn)象，下一步也將引用PCR—DGGE指紋圖譜技術(shù)等，以期望更真實(shí)地反映冰鮮銀鯧在貯藏期間的微生物菌群演替情況，對(duì)主要腐敗菌之間的相互作用以及腐敗能力進(jìn)行更深入的研究，為低溫保藏銀鯧奠定理論基礎(chǔ)。

1 黎柳，謝晶.水產(chǎn)品冰鮮技術(shù)的研究進(jìn)展［J］.食品與機(jī)械，2014，30(1):259～266.

2 Lund B M，Baird-Parker T C，Gould G W.The microbological safety and quality of food［M］.Gaithersburg Maryland，USA:Aspen Publishers Inc，2000.

3 藍(lán)蔚青，謝晶.PCR結(jié)合生理生化鑒定對(duì)冷藏帶魚(yú)主要細(xì)菌菌相組成分析［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2012，38(2):11 ～13.

4 張?chǎng)?，倪莉，黃志清，等.冰鮮大黃魚(yú)腸腔細(xì)菌類群鑒定及菌群結(jié)構(gòu)分析［J］.中國(guó)食品學(xué)報(bào)，2013，12(12):189 ～192.

5 許振偉，許鐘，楊憲時(shí)，等.大黃魚(yú)中復(fù)合腐敗菌腐敗能力的分析［J］.食品科學(xué)，2010，31(23):118 ～122.

6 藍(lán)蔚青，謝晶，施建兵，等.冷藏鯧魚(yú)貯藏期間的細(xì)菌種群變化［J］.食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2013，32(11):141 ～147.

7 唐勁松，徐安書(shū).食品微生物檢測(cè)技術(shù)［M］.北京:中國(guó)輕工業(yè)出版社，2012.

8 東秀珠，蔡妙英.常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)［M］.北京:科學(xué)出版社，2001.

9 楊憲時(shí)，許鐘，肖琳琳.水產(chǎn)食品特定腐敗菌與貨架期的預(yù)測(cè)和延長(zhǎng)［J］.水產(chǎn)學(xué)報(bào)，2004，28(1):106～111.

10 黃林，陳全勝，張燕華，等.冷卻豬肉優(yōu)勢(shì)腐敗菌分離鑒定及致腐能力測(cè)定［J］.食品科學(xué)，2013，34(1):205 ～208.

11 Ellis D I，Goodacre R.Rapid and quantitative detection of the microbial spoilage of muscle foods:current status and future trends［J］.Trends in Food Science and Technology，2001，12(1):414 ～424.