王艷++陳璐

[摘要] 目的 觀察異煙肼誘導(dǎo)致單耐異煙肼結(jié)核分枝桿菌假定藥物外排泵基因表達(dá)情況，并探討導(dǎo)致該基因高表達(dá)的原因。 方法 選取30株單耐異煙肼結(jié)核分枝桿菌分離株、20株全敏結(jié)核分支桿菌分離株和H37Rv（標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照），對(duì)不同菌株進(jìn)行無(wú)異煙肼與亞抑菌異煙肼的誘導(dǎo)培養(yǎng)，采用Real-time PCR技術(shù)檢測(cè)27個(gè)假定外排泵基因表達(dá)量的變化，并且依據(jù)2-ΔΔCT進(jìn)行計(jì)算假定藥物外排泵基因的表達(dá)差異倍數(shù)。 結(jié)果 30株單耐異煙肼結(jié)核分枝桿菌分離基因均可能導(dǎo)致結(jié)核分枝桿菌對(duì)異煙肼的假定藥物外排泵基因表達(dá)，且異煙肼會(huì)導(dǎo)致其外排泵基因的高表達(dá)。

[關(guān)鍵詞] 異煙肼；結(jié)核分枝桿菌；外排泵基因；表達(dá)量

[中圖分類號(hào)] R378 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2014）11（c）-0016-04

Preliminary study of isoniazid induced single INH resistant mycobacterium tuberculosis putative drug efflux pump gene expression variation

WANG Yan1 CHEN Lu2

1.Clinical Laboratory， Nanjing Thoracic Hospital， Jiangsu Province， Nanjing 210029， China； 2.Clinical Laboratory， Pukou District Center Hospital of Nanjing City， Jiangsu Province， Nanjing 211800， China

[Abstract] Objective To observe the expression of isoniazid induced to single resistance to isonicotinic acid hydrazide （INH） mycobacterium tuberculosis， and to discuss the possible cause of the high expression. Methods A total of 30 strains of single isoniazid resistant mycobacterium tuberculosis isolates， 20 strains of mycobacterium tuberculosis isolates and sensitivity of H37Rv （standard）， the different strains were cultured as hydrazine and sub inhibitory INH， and 27 putative efflux pump gene expression changes were detected by real-time PCR reverse transcription， and assuming multiple expression of drug efflux pump disease were calculated on the basis of 2-ΔΔCT. Results 30 strains of single INH resistant Mycobacterium tuberculosis isolates 18 strains of MIC was 2.0 μg/mL （14 strains katG 315 AGC-ACC mutations， 4 strains of non-mutant）， 8 strains of MIC was 1.0 μg/mL [4 strains katG 315 AGC-ACC mutations， 4 strains of inhA （-15） C-T mutation]， 4 strains of MIC was 4.0 μg/mL [3 strains of katG 315 AGC-ACC， 1 strain of ahpC （-88） G-A mutation]， 20 strains of Mycobacterium tuberculosis isolates sensitive without mutation. 27 putative drug discharge pump genes in the 11 genes showed high expression， mainly for Rv1258c， Rv2265， Rv0849， Rv0191， Rv1819c， Rv3239c， Rv2209， Rv2936， Rv2937， Rv1146， Rv2938c， and they were 5， 4， 4， 3， 3， 3， 2， 2， 2， 1， 1 strains/strain respectively. Conclusion In clinical， Rv1258c， Rv0849 and Rv2265 genes could lead to drugs on the assumption of ionized in mycobacterium tuberculosis efflux pump gene， and isoniazid can lead to high expression of discharge pump gene.

[Key words] Isoniazid； Mycobacterium tuberculosis； Efflux pump gene； Expression

結(jié)核病是臨床中常見疾病之一，在該病的控制過(guò)程中依然面臨著眾多問(wèn)題，常見的有耐藥問(wèn)題和人類免疫缺陷病毒與肺結(jié)核病毒的雙重感染以及流動(dòng)人口等[1]。資料顯示，結(jié)核病患者耐藥性可以達(dá)到39.0%以上。耐藥結(jié)核疾病，特別是耐多藥結(jié)核病成為了國(guó)家結(jié)核疾病控制規(guī)劃的重大阻礙，也是導(dǎo)致當(dāng)前疫情降低的最重要原因之一[2]。耐多藥結(jié)核病多數(shù)是由于異煙肼與利福平兩組或者多種藥物的拮抗作用而導(dǎo)致的。結(jié)核分枝桿菌耐藥主要是由于基因突變而導(dǎo)致藥物的作用靶位失去和細(xì)菌細(xì)胞壁的通透性發(fā)生改變，從而使得藥物不能有效地進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，并依賴主動(dòng)外排系統(tǒng)將細(xì)菌胞內(nèi)的藥物排出[3-4]。其耐藥機(jī)制主要是基因突變使得藥物的作用靶位喪失，另外細(xì)菌細(xì)胞壁通透性發(fā)生改變使得藥物不能夠直接進(jìn)入到細(xì)胞內(nèi)，依賴主動(dòng)外排系統(tǒng)將細(xì)菌胞內(nèi)的藥物排出。臨床中依據(jù)藥物外排機(jī)制的不同情況，外排泵可分為ATP水解能驅(qū)動(dòng)型與跨膜質(zhì)子梯度能驅(qū)動(dòng)型兩個(gè)類型，還可以分為5個(gè)不同的主要超家族體現(xiàn)為MFS、ABC、RND、AMR家族和MATE家族[5]。資料顯示，結(jié)核分桿菌主要是通過(guò)藥物外排泵對(duì)異煙肼藥物做出應(yīng)答反應(yīng)，從而使其產(chǎn)生耐藥[6]。因此，本研究中重點(diǎn)探討異煙肼誘導(dǎo)致單耐異煙肼結(jié)核分枝桿菌假定藥物外排泵基因表達(dá)量狀況，并分析可能導(dǎo)致單耐異煙肼結(jié)核分枝桿菌假定藥物外排泵基因高表達(dá)的具體原因，具體的分析如下：

1 材料與方法

1.1 材料

本次研究的菌株均是由中國(guó)疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所結(jié)核室所提供，30株單耐異煙肼結(jié)核分枝桿菌分離株、20株全敏結(jié)核分枝桿菌分離株、H37Rv（標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照）。

1.2 儀器與試劑

ADC營(yíng)養(yǎng)添加劑與Middlebrook 7H9干粉（美國(guó)BD公司）、異煙肼藥物干粉（美國(guó)Sigma公司）、Trizol試劑（美國(guó)Invitrogen公司）、Alamar blue試劑（美國(guó)ABD Serotec公司）；除去DNA試劑盒（美國(guó)Invitrogen公司）、熒光定量PCR儀器（美國(guó)伯樂公司）、反轉(zhuǎn)錄試劑盒與熒光染料法Real-time PCR試劑（康為公司）。

1.3 基因組檢測(cè)

基因組主要是采取十六烷基三甲溴化銨（CTAB）法進(jìn)行檢測(cè)，并且采取直接測(cè)序法進(jìn)行檢測(cè)異煙肼耐藥的相關(guān)基因。同時(shí)，將PCR產(chǎn)物進(jìn)行單向測(cè)序，并且采取生物信息學(xué)軟件對(duì)其進(jìn)行基因序列和H37Rv基因序列進(jìn)行對(duì)比分析，基因型的檢測(cè)采用Spoligotyping法進(jìn)行辨別[7]。

1.4 最小抑菌濃度（MIC）檢測(cè)

結(jié)核分枝桿菌異煙肼的MIC主要是采取微孔板Alamar blue顯色法進(jìn)行測(cè)定[8]。培養(yǎng)基中異煙肼的濃度為0.2 μg/mL，對(duì)于異煙肼MIC≤0.25 μg/mL的菌株，需要再次進(jìn)行低濃度藥物的梯度稀釋，異煙肼需要按照0.0005～0.5 μg/mL的2倍系列稀釋，藍(lán)色完全沒有發(fā)生改變?yōu)樽钚∷幬餄舛取?/p>

1.5 假定藥物外排泵基因檢測(cè)

①依據(jù)N37Rv菌株全基因組序列進(jìn)行管家基因secA1與27個(gè)假定藥物外排泵基因的選擇并設(shè)計(jì)引物。②細(xì)菌總RNA的制備，采取Trizol法進(jìn)行提取總RNA，采取分光光度計(jì)進(jìn)行測(cè)定總RNA的純度與濃度狀，以此進(jìn)行質(zhì)量測(cè)定。③去除DNA的污染，將提取的總RNA進(jìn)行去污處理。經(jīng)過(guò)上述的方法提取總RNA，體系為20.0 μL，主要包括100×DNaseⅠ

2 結(jié)果

2.1 基因突變觀察

30株單耐異煙肼結(jié)核分枝桿菌分離株中18株MIC顯示2.0 μg/mL（14株katG 315 AGC-ACC突變，4株無(wú)突變），8株MIC顯示1.0 μg/mL[4株katG 315 AGC-ACC突變，4株inhA（-15）C-T突變]，4株MIC顯示4.0 μg/mL[3株katG 315 AGC-ACC，1株ahpC（-88）G-A突變]，20株全敏結(jié)核分支桿菌分離株無(wú)突變。

2.2 假定藥物外排泵基因觀察

通過(guò)對(duì)標(biāo)準(zhǔn)株的27個(gè)假定藥物外排泵基因的表達(dá)差異倍數(shù)觀察，其差異倍數(shù)為0～1倍的10個(gè)，>1～2倍的12個(gè)，>2～3倍的5個(gè)，觀察過(guò)程中并未見有差異倍數(shù)超過(guò)3倍。同時(shí)，20株全敏結(jié)核分支桿菌分離株中的27個(gè)假定藥物外排泵基因的表達(dá)差異倍數(shù)觀察，0～1倍的13個(gè)，>1～2倍的13個(gè)，>2～3倍的1個(gè)。每個(gè)基因表達(dá)量差異倍數(shù)為0～2倍，甚至達(dá)到80.0%以上。

27個(gè)假定藥物外排泵基因中相對(duì)表達(dá)量差異倍數(shù)在部分菌株中天于4倍，一共有11個(gè)基因，主要體現(xiàn)為Rv1258c、Rv2265、Rv0849、Rv0191、Rv1819c、Rv3239c、Rv2209、Rv2936、Rv2937、Rv1146、Rv2938c。具體的株數(shù)見表2。

表2 30株單耐異煙肼結(jié)核分枝桿菌分離株中假定藥物外排泵基因高表達(dá)分布

3 討論

異煙肼是抗結(jié)核治療中的常見藥物，并且對(duì)結(jié)核桿菌具有較強(qiáng)的抑制與殺滅作用[10]。同時(shí)，其生物膜的穿透性相對(duì)比較好，且療效佳、毒性小，在臨床中被廣泛應(yīng)用。資料顯示，異煙肼對(duì)結(jié)核分枝桿菌具有較高的選擇性，且抗菌作用也是相對(duì)比較強(qiáng)。一般情況下，試管內(nèi)0.025～0.05 mg/L的濃度可以更好地抑制病菌，且臨床中較高濃度異煙肼（10.0 mg/L）對(duì)繁殖期的細(xì)菌具有較強(qiáng)的殺菌作用。同時(shí)，對(duì)于靜止期結(jié)核桿菌，能夠有效地提高藥物的濃度，或者是更好地延長(zhǎng)接觸的時(shí)間，從而達(dá)到殺菌的作用，且對(duì)細(xì)胞內(nèi)外結(jié)核桿菌也具有明顯的作用。研究顯示，異煙肼單獨(dú)使用很容易產(chǎn)生藥物的耐藥性，而聯(lián)合用藥能夠延緩藥物的耐藥性產(chǎn)生，最終增強(qiáng)其臨床療效。臨床中雖有研究進(jìn)一步對(duì)異煙肼的作用機(jī)制分析，但其具體的作用尚不明確[11]。主要分為兩種情況，第一，異煙肼被轉(zhuǎn)化為異煙酸，而異煙酸主要是作為煙酸的一種抗代謝物，并且代替煙酸結(jié)合在NAD+，最終使得受到抑制的NAD+不被催化；第二，主要是通過(guò)阻斷去飽和酶而發(fā)揮作用，異煙肼能夠有效抑制C24、C26飽和脂肪酸轉(zhuǎn)化為C24、C26不飽和脂肪酸，而且這種不飽和脂肪酸很可能為霉菌酸前體，而霉菌酸也是細(xì)菌細(xì)胞壁的一種重要成分，該藥物可以更好地抑制霉菌酸生物合成，最終使得細(xì)菌的耐酸性喪失。但是，臨床中異煙肼暴露可能會(huì)引起結(jié)核分枝桿菌出現(xiàn)基因突變，且伴有藥物外排泵的活性增加。一旦這種基因發(fā)生突變，很容易引起結(jié)核分枝桿菌分離株產(chǎn)生耐藥，最終使得異煙肼治療結(jié)核病作用降低[12]。研究顯示，除基因突變導(dǎo)致異煙肼耐藥之外，外排泵激活也可以導(dǎo)致異煙肼耐藥的情況發(fā)生[13]。因此，本研究重點(diǎn)對(duì)30株單耐異煙肼結(jié)核分枝桿菌分離株和20株全敏結(jié)核分枝桿菌分離株進(jìn)行異煙肼誘導(dǎo)，并且觀察27個(gè)假定外排泵基因的表達(dá)狀況，從而進(jìn)一步了解其呈現(xiàn)高表達(dá)的具體原因。

通過(guò)本次的臨床研究分析，臨床中27個(gè)假定藥物外排泵基因中有11個(gè)基因呈現(xiàn)高表達(dá)，且這些基因的表達(dá)狀況均不相同。數(shù)據(jù)顯示，基因主要體現(xiàn)為Rv1258c、Rv2265、Rv0849、Rv0191、Rv1819c、Rv3239c、Rv2209、Rv2936、Rv2937、Rv1146、Rv2938c。由此分析，單耐異煙肼結(jié)核分支桿菌株中存在假定藥物外排泵基因高表達(dá)的情況，其具體可能是由于假定外排泵基因中的異煙肼被大量激活，從而使其呈現(xiàn)高表達(dá)[14-15]。同時(shí)，基因突變可能與藥物外排泵的激活也具有相關(guān)性，且katG315位置的基因突變更相關(guān)[16]。本組的數(shù)據(jù)也顯示，30株單耐異煙肼結(jié)核分枝桿菌分離株中18株MIC為2.0 μg/mL（14株katG 315 AGC-ACC突變，4株無(wú)突變），8株MIC為1.0 μg/mL[4株katG 315 AGC-ACC突變，4株inhA（-15）C-T突變]，4株MIC為4.0 μg/mL[3株katG 315 AGC-ACC，1株ahpC（-88）G-A突變]。進(jìn)一步說(shuō)明，katG315位置的基因突變?cè)诩俣ㄋ幬锿馀疟没蚋弑磉_(dá)中發(fā)揮著重要的作用。臨床中相關(guān)研究顯示，多耐藥菌株可能是由于藥物外排泵基因的作用，并不是由于基因突變所引起的[17]。但是也有相關(guān)的研究顯示，外排泵基因可能起到促進(jìn)其他耐藥作用機(jī)制，從而導(dǎo)致異煙肼的耐藥[18]。由于本次的臨床研究顯示，對(duì)于基因突變與外排泵之間的相關(guān)性依然需要臨床中大量實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究，從而更準(zhǔn)確地了解異煙肼耐藥情況。但是，本研究觀察例數(shù)較少，有待大樣本進(jìn)一步研究觀察。

綜上所述，臨床中Rv1258c、Rv0849以及Rv2265等相關(guān)基因均可能導(dǎo)致結(jié)核分枝桿菌對(duì)異煙肼的假定藥物外排泵基因的高表達(dá)。

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（收稿日期：2014-08-21 本文編輯：任 念）

綜上所述，臨床中Rv1258c、Rv0849以及Rv2265等相關(guān)基因均可能導(dǎo)致結(jié)核分枝桿菌對(duì)異煙肼的假定藥物外排泵基因的高表達(dá)。

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（收稿日期：2014-08-21 本文編輯：任 念）

綜上所述，臨床中Rv1258c、Rv0849以及Rv2265等相關(guān)基因均可能導(dǎo)致結(jié)核分枝桿菌對(duì)異煙肼的假定藥物外排泵基因的高表達(dá)。

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（收稿日期：2014-08-21 本文編輯：任 念）