梁文輝，法蕓，王明林

(1.山東農業(yè)大學，食品科學與工程學院，山東泰安 271018；2.中國科學院青島生物能源與過程研究所，生物燃料重點實驗室，山東青島 266101)

在小分子糖類碳源中，蔗糖可由高等植物通過光合作用直接合成，被認為是自然界最豐富的二糖；同時蔗糖結構簡單，很多微生物可以利用，是一種較為理想的碳源。又因為藍藻具有高光效，生長速度快，遺傳操作體系相對成熟，適用于大通量的基因工程改造等一系列優(yōu)勢，通過代謝工程改造藍細菌生產蔗糖并提供給大腸桿菌等微生物發(fā)酵生產生物燃料，必將加速整個生物燃料的產業(yè)化進程，相關的研究意義重大［1，2］。

在藍細菌相關研究中，蔗糖、甘油葡糖苷（GG）等組分的準確測定是一個重要環(huán)節(jié)。蔗糖的測定方法較多，如近紅外光譜法［3］、高效液相色譜蒸發(fā)光散射檢測法［4］等。測定GG的方法包括核磁共振碳譜［5］，氣液色譜［6］和酶技術［7］等。以上方法或者操作復雜，或者使用毒性較大的淋洗液。高效液相色譜在分離含有低濃度蔗糖和GG的樣品時，RPC柱和IMPC柱的分離能力受到限制；氨基鍵合硅膠填料的色譜柱和乙腈–水作流動相能夠對GG和二糖很好地分離，但是無法分離一些重要的己糖［8］。

高效陰離子交換色譜脈沖安培檢測法是糖類檢測的有效方法，適用于單糖、二糖、小分子寡糖的測定［9］，具有靈敏度高、選擇性好等特點。這種方法已被廣泛用于食品中糖類的測定［10–17］、煙草［18］和藥物中糖類的測定［19］。筆者對離子色譜脈沖安培檢測法測定藍藻細胞培養(yǎng)液中的蔗糖和GG進行了研究。該方法前處理簡單、選擇性好、靈敏度高。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

離子色譜儀：ICS–3000型，配備雙泵、自動進樣器、電化學檢測器，美國賽默飛世爾科技有限公司；

超純水制備儀：Milli-Q?Advantage A10型，法國Millipore公司；

氫氧化鈉溶液：質量分數為50%，比利時Acros Organics公司；

蔗糖標準品：純度不小于99.5%，國家標準研究中心；

GG標準品：純度不小于99.5%，德國Bitop AG公司；

藍藻培養(yǎng)液樣品：自制；

實驗用水為電阻率18 MΩ·cm的超純水，進樣前經過0.22 μm水相濾膜過濾。

1.2 標準品的配制

準確稱取0.01 g（精確至0.001 g）經過干燥至恒重的蔗糖，用超純水定容于10 mL容量瓶中，制得1 000 mg／L的蔗糖標準儲備液。同法配制相同濃度的GG標準儲備液。

用移液槍分別準確吸取1，5，10，20，50，100，200，500，1000 μL上述兩種標準儲備液，用超純水定容于10 mL容量瓶中，質量濃度分別為0.1，0.5，1.0，2.0，5.0，10.0，20.0，50.0 mg／L。

1.3 樣品前處理

經過600 mmol／L NaCl鹽脅迫后每隔24 h取樣2 mL藍藻培養(yǎng)液，以12 000 r／min速度離心5 min，取上清液。將上清液稀釋10倍后取約10 mL溶液用0.22 μm水相濾膜過濾，過IC–RP柱除去蛋白、色素等有機雜質。

IC–RP柱（1.0 mL，Agela Technologies）使用前須先經5 mL甲醇、10 mL水活化，放置20 min后使用。當樣品溶液通過該柱時，前面3 mL棄去，后面溶液待檢測。

1.4 色譜條件

色譜柱：CarboPac MA1分析柱和保護柱(美國Thermo Scientific公司)；淋洗液：800 mmol／L氫氧化鈉溶液等度洗脫；進樣體積：25 μL；流量：0.4 mL／min；柱溫：30℃；利用Chromeleon 6.8 色譜軟件自動控制和數據處理。積分脈沖安培檢測；金工作電極；Ag／AgCl參比電極；檢測電位波形見表1。

表1 檢測電位波形

2 結果與討論

2.1 淋洗液濃度的選擇

分別考察300，500，800，1 000 mmol／L氫氧化鈉淋洗液對蔗糖和GG分離效果的影響，結果表明：淋洗液濃度在300，500 mmol／L時，蔗糖和GG已經能夠分開，但分離時間較長（超過1 h）；淋洗液濃度為800 mmol／L時，蔗糖與GG可在30 min內實現完全分離；淋洗液濃度為1 000 mmol／L時，蔗糖與GG分離效果不理想。所以選擇800 mmol／L的氫氧化鈉溶液作為淋洗液。

2.2 色譜柱的選擇

使用HPLC在分離含有低濃度蔗糖和GG的樣品時，RPC柱和IMPC柱的分離能力受到限制［8］。CarboPac PA10色譜柱能分開蔗糖和GG，但檢測實際樣品時，有雜峰和蔗糖的色譜峰重合，干擾了蔗糖檢測。利用CarboPac MA1柱分離效果較好，檢測實際樣品時，蔗糖和其它未知組分無共淋洗現象發(fā)生。蔗糖和GG標準品的分離情況如圖1 所示。

圖1 蔗糖和GG標準品的色譜圖

2.3 線性方程與檢出限

逐級稀釋蔗糖、GG標準儲備液分別得到0.10，0.50，1.00，2.00，5.00，10.00，20.00，50.00 mg／L的蔗糖和GG混合標準溶液，進樣量為25 μL，以標準品的質量濃度與對應的色譜峰面積進行線性回歸得線性方程。線性范圍、線性方程、相關系數和檢出限（S／N=3）見表2。由表2可知，蔗糖和GG線性相關系數均大于0.999 9，檢出限分別為0.15 mg／L和0.03 mg／L。

表2 線性范圍、線性方程、相關系數及檢出限

2.4 方法精密度

用2 mg／L的蔗糖和GG混合標準品重復進樣8次，測定結果見表3。由表3可知，蔗糖和GG 8次測定結果的相對標準偏差分別為0.755%和1.694%，表明本法測量精密度較高。

表3 精密度試驗結果

2.5 加標回收試驗

取藍藻培養(yǎng)液樣品，按照1.3方法處理，在1.4色譜條件下測定，然后在樣品中分別加入1.0，10.0，20.0 mg／L的蔗糖和GG混合標準品，重復試驗，測定結果見表4。由表4可知，蔗糖和GG的平均加標回收率為99.13%和94.23%，表明本法測量準確度較高。

表4 加標回收試驗結果

2.6 樣品測定

應用此方法測定5種不同時間間隔取樣的藍藻細胞培養(yǎng)液中的蔗糖和GG，樣品中蔗糖和GG的含量測定結果見表5，樣品色譜圖如圖2所示。由圖2可見，蔗糖和GG相互之間及其與樣品基底成分分離良好，測定無干擾。

表5 不同藍藻培養(yǎng)液樣品中的蔗糖和GG含量 mg／L

3 結語

離子色譜脈沖安培檢測法測定藍藻培養(yǎng)液中的蔗糖和GG，最低檢測限分別達到0.03 mg／L和0.15 mg／L，比高效液相色譜蒸發(fā)光散射檢測法測定蔗糖的最低檢測線14 mg／L要低［4］。測量精密度和準確度滿足要求，可用于藍藻細胞培養(yǎng)液中蔗糖和GG的同時測定。

圖2 不同藍藻細胞培養(yǎng)液中蔗糖和GG的色譜圖

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