趙紹輝， 周景文， 堵國(guó)成， 陳 堅(jiān)

（江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無(wú)錫 214122）

釀酒酵母是與人類(lèi)關(guān)系最密切的一種酵母，傳統(tǒng)上它用于釀酒和制作發(fā)酵食品，在現(xiàn)代分子生物學(xué)中它作為真核模式菌株。在食品安全方面，釀酒酵母發(fā)酵過(guò)程中由于氮源利用的不同，會(huì)產(chǎn)生一些危害人體健康的胺類(lèi)化合物，氨基甲酸乙酯是其中受關(guān)注較多的一種[1-2]。目前對(duì)胺類(lèi)物質(zhì)產(chǎn)生機(jī)理研究得還不透徹，并且大部分研究集中在基因組以及轉(zhuǎn)錄組方面。對(duì)于生物體來(lái)說(shuō)，基因的功能主要通過(guò)它編碼的蛋白質(zhì)來(lái)實(shí)現(xiàn)，因此蛋白質(zhì)是生命活動(dòng)的真正執(zhí)行者。生物體的基因組相對(duì)來(lái)說(shuō)是固定的，但它的蛋白質(zhì)組是動(dòng)態(tài)的，同一基因組在不同細(xì)胞、不同組織中的蛋白質(zhì)表達(dá)情況各不相同。即使是同一細(xì)胞，在不同的生長(zhǎng)階段、不同的生理?xiàng)l件，以及不同的環(huán)境影響下，其蛋白質(zhì)組的存在狀態(tài)也都不盡相同，因此蛋白質(zhì)組是空間和時(shí)間上變化的整體。通過(guò)直接對(duì)細(xì)胞表達(dá)的全局蛋白質(zhì)進(jìn)行研究，可以更準(zhǔn)確地搞清基因調(diào)控的機(jī)理和生命活動(dòng)的本質(zhì)過(guò)程[3]。

隨著檢測(cè)技術(shù)與信息技術(shù)的迅速發(fā)展，基因組研究已經(jīng)取得了很多重大的進(jìn)展和成就。然而蛋白質(zhì)組由于其自身的復(fù)雜性和不穩(wěn)定性，至今尚未得到像基因組研究一般通用、簡(jiǎn)便、高效的技術(shù)支持[4]。雙向電泳與質(zhì)譜結(jié)合的研究方法，是現(xiàn)在蛋白質(zhì)組學(xué)最為常規(guī)的實(shí)驗(yàn)技術(shù)。由于雙向電泳實(shí)驗(yàn)操作性強(qiáng)、步驟繁瑣、周期長(zhǎng)，實(shí)驗(yàn)過(guò)程各個(gè)環(huán)節(jié)都可能影響雙向電泳對(duì)蛋白質(zhì)分離的效果，直接關(guān)系到蛋白質(zhì)圖譜分析的準(zhǔn)確性和可靠性，因此對(duì)于不同來(lái)源的樣品，即便是同一物種也都需要摸索優(yōu)化出專(zhuān)用的實(shí)驗(yàn)室可重復(fù)的實(shí)驗(yàn)條件[5-6]。本研究的目標(biāo)就是通過(guò)對(duì)影響雙向電泳結(jié)果的各種關(guān)鍵條件進(jìn)行優(yōu)化，建立一套高分辨率、高靈敏度、高重復(fù)度和高穩(wěn)定性的雙向電泳技術(shù)體系。為深入研究不同氮源條件下釀酒酵母的差異蛋白質(zhì)組學(xué)提供可靠依據(jù)，進(jìn)而為研究氮代謝本質(zhì)調(diào)控過(guò)程奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 菌株與培養(yǎng)條件

1）菌株：Saccharomyces cerevisiae N85，由浙江古越龍山紹興酒股份有限公司提供。

2）培養(yǎng)條件：從甘油管中取400 μL菌體接入到20 mL的YPD培養(yǎng)基，30℃，200 r/min，培養(yǎng)至20 h取樣。

1.1.2 試劑 固化IPG線性干膠條、兩性電解質(zhì)Bio-Lyte，購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司；丙烯酰胺、甲叉丙烯酰胺、尿素、硫脲、3-（3-膽胺丙基）二甲氨基-1-丙磺酸（CHAPS）、二硫蘇糖醇（DTT）、碘乙酰胺（IAA）、甘氨酸、三羥甲基氨基甲烷（Tris）、四甲基乙二胺（TEMED）、過(guò)硫酸銨、溴酚藍(lán)、低熔點(diǎn)瓊脂糖、十二烷基磺酸鈉（SDS）、考馬斯亮藍(lán)G-250、蛋白酶抑制劑、蛋白測(cè)定試劑盒，購(gòu)自上海生工集團(tuán)；甲醇、正丁醇、冰醋酸、甘油、三氯乙酸（TCA）、磷酸、乙酸鈉，均為國(guó)產(chǎn)分析純產(chǎn)品。

1.1.3 主要儀器 Ettan IPG-phor 3型等電聚焦電泳儀，Ettan DALTsix垂直電泳系統(tǒng)，Image Master LabScan凝膠電泳圖像分析系統(tǒng)，GE公司產(chǎn)品；CR22G型高速冷凍離心機(jī)，日本日立公司產(chǎn)品；UV-2100型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，尼龍柯儀器有限公司產(chǎn)品；PD-Quest 8.0.1分析軟件，美國(guó)Bio-Rad公司研發(fā)。

1.2 方法

1.2.1 蛋白質(zhì)提取 取100 mL酵母培養(yǎng)液離心（7 000 r/min，15 min），棄去上清。 用 100 mL 超純水懸浮洗滌菌體，離心（7 000 r/min，15 min），重復(fù) 3次得菌體沉淀。用2 mL細(xì)胞裂解液（7 mol/L尿素、2 mol/L硫脲、質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%CHAPS）懸浮酵母細(xì)胞，加入20 μL蛋白酶抑制劑。冰浴中超聲破碎（3 s/2 s）30 min，期間盡量低溫，完畢后離心（14 000 r/min，30 min）。

1）丙酮沉淀法：將上清液轉(zhuǎn)移到50 mL的離心管中，加入10倍體積丙酮溶液沉淀蛋白質(zhì)，-20℃放置過(guò)夜。離心（14 000 r/min，30 min）獲得蛋白質(zhì)沉淀。

2）TCA-丙酮沉淀：將上清液轉(zhuǎn)移到50 mL離心管中，加入10倍體積TCA-丙酮溶液沉淀蛋白質(zhì)，-20 ℃放置過(guò)夜，離心（14 000 r/min，30 min）。用丙酮溶液懸浮洗滌沉淀，放置1 h，離心（14 000 r/min，30 min），重復(fù)兩次，得蛋白質(zhì)沉淀。

3）使用GE公司的clean-up試劑盒進(jìn)行蛋白質(zhì)沉淀。

將蛋白質(zhì)沉淀溶于1 mL上樣水化緩沖液（7 mol/L尿素、2 mol/L硫脲、質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%CHAPS、65 mmol/L DTT、 質(zhì)量分?jǐn)?shù) 1%pH 3～10的 Bio-Lyte）中，放置 1 h 后離心（12 000 r/min，5 min），取上清，使用上海生工集團(tuán)的非干擾性蛋白質(zhì)濃度測(cè)定試劑盒，-20℃冷凍待用。

1.2.2 雙向電泳 按照GE公司的 《雙向電泳操作手冊(cè)》進(jìn)行水化上樣、等電聚焦、平衡，以及第二向SDS-PAGE電泳。等電聚焦時(shí)采用電壓逐步優(yōu)化方案對(duì)聚焦條件進(jìn)行優(yōu)化，第二向分別采用質(zhì)量分?jǐn)?shù)12%、14%和15%的丙烯酰胺凝膠進(jìn)行比較優(yōu)化。簡(jiǎn)要步驟如下：按表1要求的上樣量，測(cè)定出蛋白質(zhì)濃度，計(jì)算出需要的稀釋體積。干膠條在含有蛋白質(zhì)樣品的上樣水化液中水化過(guò)夜。水化過(guò)夜后的膠條轉(zhuǎn)移到等電聚焦儀器，設(shè)定程序進(jìn)行等電聚焦，結(jié)束后立即進(jìn)行平衡。采用兩步平衡法，IPG膠條先后在平衡液I和平衡液II中平衡。進(jìn)行第二向電泳，當(dāng)溴酚藍(lán)條帶移至凝膠底部時(shí)結(jié)束。

表1 雙向電泳蛋白質(zhì)上樣量Table 1 Sampling amount of 2-DE

分別采用改良膠體考馬斯亮藍(lán)G-250染色法和銀染法對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行染色[7]。脫色后的雙向電泳凝膠用GE公司的凝膠電泳圖像分析系統(tǒng)Image Master LabScan對(duì)其進(jìn)行掃描分析。利用伯樂(lè)公司PDQuest 8.0.1軟件進(jìn)行圖像分析處理。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同蛋白質(zhì)提取及純化方法對(duì)雙向電泳圖譜的影響

樣品的制備方法是影響雙向電泳結(jié)果的關(guān)鍵因素，制備方法如果選擇不當(dāng)，會(huì)造成蛋白質(zhì)溶解不充分、蛋白質(zhì)丟失，以及大量雜質(zhì)（鹽離子、核酸等）殘留等，嚴(yán)重影響等電聚焦過(guò)程，從而影響雙向電泳的最終結(jié)果。高效合理的樣品制備可以有效地溶解蛋白質(zhì)，并除去蛋白質(zhì)樣品中的大量雜質(zhì)，有助于消除條紋，使圖譜更加清晰，分辨率更高[8-9]。因此對(duì)樣品提取過(guò)程做以下優(yōu)化。

細(xì)胞裂解時(shí)胞內(nèi)的蛋白酶會(huì)釋放出來(lái)，造成大量蛋白質(zhì)的降解，因此在提取蛋白質(zhì)時(shí)有必要加入合適的蛋白酶抑制劑，但是在蛋白質(zhì)提取過(guò)程中加入蛋白酶抑制劑可能會(huì)對(duì)蛋白質(zhì)有所修飾，從而對(duì)雙向電泳結(jié)果產(chǎn)生影響[10-11]。因此，本實(shí)驗(yàn)中對(duì)比了不添加（圖 1（a））或者添加（圖 1（b））蛋白酶抑制兩種情況下蛋白質(zhì)圖譜的最終結(jié)果。圖1（a）（b）相差不大，可以看出蛋白質(zhì)在提取體系中的降解不是很?chē)?yán)重，添加蛋白酶抑制劑對(duì)蛋白質(zhì)的修飾也不是很?chē)?yán)重，用PD-Quest軟件分析后發(fā)現(xiàn)添加蛋白酶抑制劑的一組（圖 1（b））比未添加的一組（圖 1（a））蛋白質(zhì)點(diǎn)稍多一些（493∶504），因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)均添加蛋白酶抑制劑。

細(xì)胞破碎后胞內(nèi)很多物質(zhì)會(huì)與蛋白質(zhì)一起被提取出來(lái)，這些雜質(zhì)會(huì)使凝膠上產(chǎn)生條紋，影響后續(xù)的雙向電泳，因此很有必要對(duì)提取的蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行純化，使其適合做雙向電泳分析[9]。試驗(yàn)對(duì)比了3種純化蛋白質(zhì)的方法，分別是：丙酮沉淀法，TCA/丙酮沉淀法，Clean-up 試劑盒法。 從圖 1（c）（d）（e）中可以看出，丙酮沉淀法所得的雙向電泳圖譜在酸性端有明顯的橫條紋，蛋白質(zhì)點(diǎn)也不是很多，有文獻(xiàn)證明丙酮沉淀后有相當(dāng)部分的蛋白質(zhì)不能再?gòu)?fù)溶[9]。TCA/丙酮沉淀法對(duì)條紋有所緩解，但酸性端仍有部分橫條紋未被除去。TCA/丙酮沉淀處理后蛋白質(zhì)點(diǎn)的數(shù)量也有所增加，說(shuō)明蛋白質(zhì)的復(fù)溶效果比丙酮沉淀法要好。用Clean-up試劑盒所得圖譜在條紋和蛋白質(zhì)復(fù)溶方面都有很大的改善，所得圖譜分辨率最高，蛋白質(zhì)點(diǎn)最多，效果最好。因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)大部分會(huì)采用Clean-up試劑盒做蛋白質(zhì)純化，但由于其價(jià)格昂貴，有少部分試驗(yàn)仍會(huì)使用TCA/丙酮沉淀法。

圖1 利用不同蛋白質(zhì)提取方法所得雙向電泳圖譜Fig.1 2-DE map of protein sample extracted by different methods

2.2 不同凝膠參數(shù)對(duì)雙向電泳圖譜的影響

預(yù)制IPG膠條pH范圍的選擇對(duì)最終實(shí)驗(yàn)效果影響很大，大范圍的膠條對(duì)蛋白質(zhì)的覆蓋率大，相對(duì)分辨率較低，小范圍的膠條正好相反[12]。根據(jù)釀酒酵母的基因數(shù)據(jù)庫(kù)，得到其5 867個(gè)開(kāi)放閱讀框，由其基因序列推測(cè)出蛋白質(zhì)序列，進(jìn)而推測(cè)出蛋白質(zhì)的PI值和相對(duì)分子質(zhì)量，利用JVirGel軟件構(gòu)建了釀酒酵母理論全蛋白質(zhì)二維分布圖[13]。從圖2理論分布可知，釀酒酵母有94%的蛋白質(zhì)分布在pH 3～10范圍內(nèi)，酸性蛋白質(zhì)和堿性蛋白質(zhì)偏多，中性蛋白質(zhì)偏少。根據(jù)以上結(jié)果，本實(shí)驗(yàn)先用7 cm pH 3～10的 IPG 膠條做預(yù)實(shí)驗(yàn)，由圖 1（a）（b）可以看出，蛋白質(zhì)在整塊凝膠pH范圍上都有分布，并且分辨率尚可，因此后續(xù)均采用pH 3～10的IPG膠條。

第二向SDS-PAGE對(duì)蛋白質(zhì)點(diǎn)的分布也有一定影響，它是通過(guò)蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量不同將蛋白質(zhì)點(diǎn)分離開(kāi)來(lái)。凝膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)高時(shí)，垂直方向蛋白質(zhì)較為密集，分辨率不高；質(zhì)量分?jǐn)?shù)低時(shí)蛋白質(zhì)移動(dòng)速度快，容易跑出凝膠[14]。因此，實(shí)驗(yàn)中使用了3種不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的丙烯酰胺凝膠做對(duì)比，結(jié)果如圖3所示。由圖可以看出，質(zhì)量分?jǐn)?shù)12%的凝膠所得的圖譜蛋白質(zhì)點(diǎn)聚集在凝膠底部，質(zhì)量分?jǐn)?shù)15%的底部有一部分空白，只有質(zhì)量分?jǐn)?shù)14%的蛋白質(zhì)點(diǎn)分布較為均勻，因此以后實(shí)驗(yàn)均采用14%的丙烯酰胺凝膠進(jìn)行SDS-PAGE。

圖2 根據(jù)預(yù)測(cè)的蛋白質(zhì)等電點(diǎn)和相對(duì)分子質(zhì)量構(gòu)建的釀酒酵母理論全蛋白質(zhì)二維分布圖Fig.2 Representation of 2-DE gel separation of the Saccharomyces cerevisiae proteome according to predicted pI andmolecular weights

圖3 不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的丙烯酰胺凝膠所得雙向電泳圖譜Fig.3 2-DE maps of Saccharomyces cerevisiae by different concentration of acrylamide gel

2.3 染色方法對(duì)蛋白質(zhì)點(diǎn)檢測(cè)的影響

不同的凝膠染色方法對(duì)雙向電泳成像效果以及蛋白質(zhì)點(diǎn)的檢測(cè)有很大影響[7]，試驗(yàn)對(duì)比了常用的考馬斯藍(lán)G-250染色法和銀染法（圖4），已知兩種染色方法各有優(yōu)勢(shì)，但又各有不足。可以看出，銀染法靈敏度高，少量蛋白質(zhì)即可檢測(cè)到，但銀染步驟復(fù)雜，染色時(shí)間不容易控制，染色后底色深并且對(duì)后續(xù)的質(zhì)譜分析有影響；考馬斯藍(lán)G-250染色法操作簡(jiǎn)單，無(wú)毒性，染色后底色不深，對(duì)比度較高，并且可以與下游質(zhì)譜友好兼容。由于大部分實(shí)驗(yàn)需要質(zhì)譜鑒定差異蛋白質(zhì)點(diǎn)，綜合考慮，本實(shí)驗(yàn)后續(xù)選擇考馬斯藍(lán)G-250染色法對(duì)凝膠進(jìn)行染色。

圖4 不同染色方法所得雙向電泳圖譜Fig.4 2-DE maps of Saccharomyces cerevisiaeby different staining methods

2.4 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

由于雙向電泳步驟繁雜，試驗(yàn)周期長(zhǎng)，影響因素很多，實(shí)驗(yàn)結(jié)果往往具有不穩(wěn)定性。為了保證最大程度地從蛋白質(zhì)二維圖像中獲得可靠的生物學(xué)信息，良好的重復(fù)性是不可或缺的[15]。本實(shí)驗(yàn)中利用上述建立的方案，相同樣品進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)，進(jìn)行重復(fù)性驗(yàn)證。由圖5可以看出，3個(gè)重復(fù)樣品的電泳圖譜分辨率清晰，蛋白質(zhì)點(diǎn)的分離效果較好。利用PDQuest軟件分析，3張圖譜中蛋白質(zhì)點(diǎn)的匹配率可以達(dá)到88.5%以上，證明利用本試驗(yàn)建立的實(shí)驗(yàn)方案不僅可以得到較高分辨率的雙向電泳圖譜，同時(shí)具有較好的重復(fù)性，所得數(shù)據(jù)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖5 釀酒酵母總蛋白雙向電泳圖譜的重復(fù)性Fig.5 Repeatability of 2-DE maps with the total proteins separated from Saccharomyces cerevisiae

3 結(jié)語(yǔ)

在后基因組時(shí)代，功能基因組學(xué)越來(lái)越受到人們的關(guān)注，作為生命活動(dòng)的真正執(zhí)行者，全局蛋白質(zhì)研究也逐步走入了生命機(jī)制研究的核心領(lǐng)域[3]。作為蛋白質(zhì)組學(xué)的常規(guī)技術(shù)，雙向電泳在全局蛋白質(zhì)分離方面有著分辨率高、適用范圍廣、單次分離蛋白質(zhì)數(shù)量多等特有的優(yōu)點(diǎn)。但又由于雙向電泳實(shí)驗(yàn)操作性強(qiáng)、步驟繁瑣、周期長(zhǎng)等因素，使得雙向電泳操作過(guò)程中會(huì)出現(xiàn)各種各樣的問(wèn)題，所以對(duì)不同來(lái)源的樣品需要進(jìn)行雙向電泳方法的建立，并不斷進(jìn)行摸索和優(yōu)化。影響雙向電泳結(jié)果的因素包括試劑的純度、樣品的制備方法、樣品上樣量、等電聚焦程序、染色方法、凝膠參數(shù)、實(shí)驗(yàn)技術(shù)的熟練程度等[16-17]。加之釀酒酵母作為真核生物，其細(xì)胞結(jié)構(gòu)較原核生物來(lái)說(shuō)有一定的復(fù)雜性，因此它的蛋白質(zhì)雙向電泳圖譜的優(yōu)化工作具有重要的意義。

為了獲得高分辨率、高靈敏度、高重復(fù)性、高穩(wěn)定性的雙向電泳圖譜，試驗(yàn)比較了不同的蛋白質(zhì)提取、純化方法，調(diào)整優(yōu)化了適用于實(shí)驗(yàn)室條件下釀酒酵母的雙向電泳體系。經(jīng)過(guò)各個(gè)條件優(yōu)化，選取了超聲破碎法進(jìn)行細(xì)胞破碎，在破碎過(guò)程中添加蛋白酶抑制劑，然后用clean-up試劑盒對(duì)蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行純化處理，選擇24 cm pH范圍3～10的IPG預(yù)制膠條，以質(zhì)量分?jǐn)?shù)為14%的丙烯酰胺凝膠進(jìn)行雙向電泳實(shí)驗(yàn)，然后再選取考馬斯藍(lán)G-250染色法對(duì)凝膠進(jìn)行染色。最終作者建立起本實(shí)驗(yàn)室條件下分辨率較高、重復(fù)性較好、無(wú)明顯橫縱條紋的釀酒酵母N85全蛋白質(zhì)雙向電泳圖譜（圖 1（e）），經(jīng) PDQuest軟件分析，所得圖譜約分離到1 000個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)，該圖譜的構(gòu)建為后續(xù)釀酒酵母的蛋白質(zhì)組學(xué)研究奠定了基礎(chǔ)。

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