梁園園，宋 博，康 白(青島濱海學院醫(yī)學院基礎醫(yī)學教研室，青島 266555;通訊作者，E-mail:baik615@126．com)

更年期女性肥胖已成為臨床上一種常見病、多發(fā)病，與女性乳腺癌、糖尿病等疾病的發(fā)生密切相關［1］。研究發(fā)現(xiàn)，瘦素抵抗是更年期女性產(chǎn)生肥胖的重要原因［2］。然而，瘦素抵抗確切的發(fā)生機制目前仍未闡明。新近研究發(fā)現(xiàn)，細胞因子信號轉(zhuǎn)導抑制因子 -3(suppressor of cytokine sighting-3，SOCS-3)是瘦素信號轉(zhuǎn)導中的主要抑制因子，在瘦素抵抗發(fā)生過程中起著重要作用［3］。另有研究表明，TNF-α和IL-6能夠誘導SOCS-3基因表達升高，從而抑制瘦素信號轉(zhuǎn)導，誘導產(chǎn)生瘦素抵抗。本研究采用RIA、ELISA、RT-PCR等方法，從功能和基因的角度，觀察去勢更年期雌性大鼠瘦素抵抗與TNF-α和IL-6水平及SOCS-3基因表達的影響，探討去勢后雌性肥胖大鼠瘦素抵抗的發(fā)生機制，為更年期女性肥胖起相關疾病的防治提供重要的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 實驗動物

健康成年雌性未孕SD大鼠20只，10周齡，體引質(zhì)量180-220 g，由山東魯抗實驗動物中心提供，實驗動物質(zhì)量合格證號:SCXK魯20080002。

1．2 實驗試劑與儀器

瘦素放免試劑盒(北京普爾偉業(yè)生物科技有限公司)，IL-6 ELISA試劑盒(濟南凱晨生物科技有限公司)，TNF-α ELISA檢測試劑盒(上海麗臣生物科技有限公司)，UNIQ-10柱式總RNA抽提試劑盒、MMuLV第一鏈cDNA合成試劑盒均為上海生工生物工程有限公司產(chǎn)品，PCR擴增試劑盒(大連寶生物)。iMARK酶標儀(美國 Bio-Rad公司)，5804R臺式高速低溫離心機(德國Eppendor公司)，凝膠電泳成像分析系統(tǒng)(美國Alpha Innotech公司)，梯度PCR儀(德國Eppendor公司)。

1．3 引物

SOCS-3引物和 β-actin引物采用軟件 Primer Express 5．0設計，引物序列信息如下，由上海生工生物工程有限公司合成。β-actin上游引物序列:5＇-TTGTAACCAACTGGGACGATATGG-3＇，下游引物序列:5＇-GATCTTGATCTTC ATGGTGCTAGG-3＇，擴增片段總長度為764 bp;SOCS-3上游引物序列:5＇-TCACCCACAGCAAGTTTCC-3＇，下游引物序列:5＇-GGATGCGT AGGTTCTTGGTC-3＇，擴增片段總長度為282 bp。

1．4 去勢大鼠更年期模型的建立

選健康成年雌性未孕SD大鼠20只，隨機分為兩組:空白對照組(sham組)和摘卵巢去勢組(OVX組)。去勢更年期組大鼠按經(jīng)典大鼠去勢法進行去勢手術。術前禁食12 h，腹腔注射麻醉大鼠，達到麻醉效果后，消毒處理手術區(qū)域。在大腿附近沿背脊后正中線向頭部作一長為10 cm左右的縱形切口。用鈍性分離的方法將組織與表皮分離，向右側(cè)牽拉切口至大腿附近的骶脊肌，用止血鉗固定。于骶脊肌處通過鈍性分離剪采用鈍性分離的方法分離，為擴大手術視野用拉鉤向右拉開覆蓋的肌肉，即可見一些顏色發(fā)白的脂肪組織，用無齒鑷輕輕將脂肪組織夾出，同時尋找紅色顆粒狀的組織即卵巢。用止血鉗夾住卵巢，并用絲線結(jié)扎，然后用組織剪剪除右側(cè)卵巢。將脂肪組織輕輕送回腹腔內(nèi)，用絲線縫合鈍性分離口。向左側(cè)牽拉切口，用同樣的方法取出左側(cè)卵巢。雙側(cè)卵巢均摘除后，在表皮與肌肉間撒青霉素粉，以防感染。然后用5號絲線縫合皮膚切口，用酒精擦拭切口進行常規(guī)消毒，并在手術部位覆蓋一層無菌紗布。手術完畢后，將大鼠置于烤燈下保溫至完全清醒。術后3 d分別通過肌肉注射的方法給予5萬U/只的青霉素，防止感染。另10只大鼠，采用同樣的方法，在卵巢周圍取出與卵巢等體積的脂肪組織，為sham組。術后常規(guī)喂養(yǎng)30 d，由頸總動脈取血約5 ml，用放射免疫分析法(RIA)測定正常大鼠和去勢大鼠血清(E2)、孕酮(P)水平，以確定大鼠更年期模型的建立。

1．5 去勢對雌性大鼠血清 LEP、TNF-α和 IL-6水平的影響

按上述方法取血，用RIA測定兩組大鼠血清瘦素(LEP)含量，用ELISA法分析各組大鼠血清中IL-6及TNF-α的水平。操作步驟均按試劑盒說明書進行。同時每周稱重一次，觀察大鼠體重的變化。

1．6 去勢對雌性大鼠脂肪組織SOCS-3 mRNA表達的影響

mRNA提取:取大鼠脂肪組織約35 mg，迅速置于液氮中研磨勻漿，操作步驟嚴格按照試劑盒說明書進行，提取脂肪組織mRNA。逆轉(zhuǎn)錄RT反應按試劑盒合成第一鏈cDNA，PCR擴增SOCS-3基因和β-actin基因。RT-PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳后用計算機圖像分析儀掃描，經(jīng)凝膠圖像分析系統(tǒng)，對產(chǎn)物的電泳條帶進行灰度分析，并比較目的片段和內(nèi)參照灰度比值(平均灰度值)。

1．7 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 17．0系統(tǒng)軟件對數(shù)據(jù)進行處理分析，各組結(jié)果分別以±s表示，采用兩獨立樣本t檢驗，P＜0．05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2．1 去勢對雌性大鼠血清瘦素、TNF-α、IL-6水平的影響

與sham組比較，OVX組大鼠血清E2和P的含量均顯著降低(P＜0．01)，血清瘦素、TNF-α和IL-6的水平則明顯升高(P＜0．01，見表1)。

表1 去勢對雌性大鼠血清E2、P、瘦素、TNF-α和IL-6水平的影響(±s，n=10)Table 1The serum levels of E2，progesterone，leptin，TNF-α and IL-6 in OVX rats(±s，n=10)

表1 去勢對雌性大鼠血清E2、P、瘦素、TNF-α和IL-6水平的影響(±s，n=10)Table 1The serum levels of E2，progesterone，leptin，TNF-α and IL-6 in OVX rats(±s，n=10)

與 sham 組相比，*P ＜0．05，＊＊P ＜0．01

組別 體質(zhì)量(g) E2(ng/L) P(ng/L) LEP(μg/ml) TNF-α(pg/ml) IL-6(pg/ml)sham 組 236．1 ±25．4 20．1 ±8．02 12．5 ±4．1 2．53 ±1．70 0．068 4 ±0．013 5 32．913 ±10．622 OVX 組 264．3 ±40．5* 10．2 ±1．39＊＊ 4．1 ±2．9＊＊ 6．40 ±2．02＊＊ 0．090 2 ±0．016 2＊＊ 54．832 ±9．203*

2．2 去勢對雌性大鼠脂肪組織SOCS-3 mRNA的影響

瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，OVX組PCR產(chǎn)物濃度明顯大于sham組(見圖1)，灰度值分析結(jié)果表明，去勢組大鼠脂肪組織SOCS-3 mRNA表達顯著升高(P ＜0．01，見表2)。

圖1 兩組大鼠脂肪組織SOCS-3 mRNA的表達Figure 1 SOCS-3 mRNA expression in adipose of ovariectormized rats

表2 去勢對雌性大鼠脂肪組織SOCS-3 mRNA的影響(±s)Table 2 The levels of SOCS-3 in adipose of OVX rats by PCR(±s)

表2 去勢對雌性大鼠脂肪組織SOCS-3 mRNA的影響(±s)Table 2 The levels of SOCS-3 in adipose of OVX rats by PCR(±s)

與sham組相比，*P＜0．05

組別 n SOCS-3(%)sham組10 0．43 ±0．125 OVX 組 10 0．76 ±0．094*

3 討論

肥胖嚴重威脅著更年期女性的身心健康。更年期肥胖是女性卵巢功能衰退、雌激素減少、下丘腦-垂體-卵巢軸平衡失調(diào)所引起的機體內(nèi)分泌系統(tǒng)異常和脂質(zhì)代謝紊亂性疾病。本實驗結(jié)果表明，大鼠摘除卵巢去勢后，血清E2和P的含量均較空白對照組明顯降低，而體重卻顯著升高。這與人類更年期女性肥胖的表現(xiàn)和內(nèi)分泌改變相一致。

瘦素(leptin)是由脂肪細胞分泌的一種由肥胖基因編碼的和167個氨基酸組成的分泌型蛋白質(zhì)。大量研究表明，肥胖者體內(nèi)血清leptin水平增高提示肥胖癥常存在著瘦素抵抗現(xiàn)象。瘦素抵抗是指機體組織對瘦素的調(diào)節(jié)作用不敏感或無反應。目前認為，瘦素抵抗是導致肥胖的主要原因［2］。本實驗中，摘卵巢去勢后的更年期大鼠血清leptin水平較空白對照組顯著升高，出現(xiàn)瘦素抵抗現(xiàn)象。SOCS-3作為瘦素信號傳導通路中的主要反饋抑制因子參與瘦素抵抗的發(fā)生［3-5］。SOCS-3升高是瘦素抵抗的標志［6，7］，SOCS-3 能夠通過SH2 結(jié)構(gòu)域與JAK 分子磷酸化的酪氨酸殘基結(jié)合，抑制JAK分子的自身酪氨酸磷酸化作用，導致JAK蛋白不能活化為JAK酪氨酸激酶，抑制了leptin的JAK/STAT通路的傳導過程，最終導致瘦素抵抗，進而導致肥胖的發(fā)生。有研究證實leptin、TNF-α、IL-6等可誘導SOCS-3的基因表達，SOCS-3的表達產(chǎn)物又可以阻礙這些細胞因子的信號傳導［8，9］。又有研究表明［3］，瘦素抵抗常伴有TNF-α、IL-6等炎癥因子水平增高。本實驗中，摘卵巢去勢更年期組大鼠血清TNF-α和IL-6的水平較空白對照組明顯升高，同時摘卵巢去勢后更年期大鼠脂肪組織SOCS-3 mRNA表達顯著升高。因此，去勢后更年期雌性大鼠發(fā)生肥胖的瘦素抵抗機制可能與TNF-α、IL-6水平升高從而進一步誘導脂肪組織SOCS-3基因表達升高有關。

綜上所述，通過觀察去勢后更年期雌性大鼠血清中l(wèi)eptin、TNF-α和IL-6含量及脂肪組織SOCS-3基因表達的改變，從分子生物學的水平探究更年期女性肥胖的發(fā)生機制，為臨床更年期女性肥胖病及相關疾病的防治提供重要的理論依據(jù)。

［1］Maccio A，Madeddu C．Obesity，inflammation，and postmenopausal breast cancer:therapeutic implications［J］．Sci World J，2011，1:2020-2036．

［2］Power ML，Schulkin J．Sex differences in fat storage，fat metabolism，and the health risks from obesity:possible evolutionary origins［J］．Br J Nutr，2008，99(5):931-940．

［3］Cheng L，Yu Y，Szabo A，et al．Palmitic acid induces central leptin resistance and impairs hepatic glucose and lipid metabolism in male mice［J］．J Nutr Biochem，2015，26(5):541-548．

［4］Bjorbaek C，Elmquist JK，F(xiàn)rantz JD，et al．Identification of SOCS-3 as a potential mediator of central leptin resistance［J］．Mol Cell，1998，1(4):619-625．

［5］Dunn SL，Bjornholm M，Bates SH，et al．Feedback inhibition of leptin receptor/Jak2 signaling via Tyr1138 of the leptin receptor and suppressor of cytokine signaling 3［J］．Mol Endocrinol，2005，9(4):925-938．

［6］Wang Z，Zhou YT，Kakuma T，et al．Leptin resistance of adipocytes in obesity:role of suppressors of cytokine signaling［J］．Biochem Biophys Res Commun，2000，277(1):20-26．

［7］Bjorbaek C，El-Haschimi K，F(xiàn)rantz JD，et al．The role of SOCS-3 in leptin signaling and leptin resistance［J］．J Biol Chem，1999，274(42):30059-30065．

［8］Emanuelli B，Peraldi P，F(xiàn)illoux C，et al．SOCS-3 is an insulin-induced negative regulator of insulin signaling［J］．J Biol Chem，2000，275(21):15985-15991．

［9］Dey BR，F(xiàn)urlanetto RW，Nissley P．Suppressor of cytokine signaling(SOCS)-3 protein interacts with the insulin-like growth factor-Ⅰreceptor［J］．Biochem Biophys Res Commun，2000，278(1):38-43．