王丹楊，汪 鵬，馬新?lián)P，李 雪，阮建平(西安醫(yī)學院口腔醫(yī)學系口腔修復學教研室，西安 700;西安交通大學口腔醫(yī)院預防科;通訊作者，E-mail:xiaocha830803@63．com)

根面齲一直是老年人口腔的常見病和多發(fā)病，隨著我國中老年人口激增，根面齲發(fā)病率呈現顯著上升趨勢。由于根方牙體硬組織的結構及成分異于冠方，硬度較牙冠低，抗齲能力變差，同時位置較隱蔽，經常被忽視，因此更容易出現齲損病癥。牙體硬組織不含細胞，缺乏自身修復能力，一旦齲洞形成則無法逆轉，只能依靠傳統(tǒng)治療原則去腐充填，并發(fā)癥嚴重。如何預防根面齲的形成以及早期醫(yī)療干預意義尤為重要［1］。橙皮甙(hesperidin，HPN)是一種柑橘屬植物的提取物，屬生物黃酮類化合物。最新研究表明，橙皮甙可以保護膠原纖維并促進牙體硬組織再礦化［2］。本實驗通過觀察橙皮甙預處理對根方牙本質耐脫礦能力的影響，以期為研究天然藥物防治根面齲提供參考。

1 材料和方法

1．1 主要材料和儀器

橙皮甙(純度≥98%，西安開來生物工程有限公司);乙酸、氟化鈉、氫氧化鈉、磷酸二氫鉀(均為分析純)、戊二醛、無水乙醇(西安化學試劑廠);4-羥乙基哌嗪乙磺酸(hydroxyethyl piperazine ethanesulfonic acid，HEPES)(Sigma 公司，美國);磷酸鹽緩沖液(Phosphate Buffered Saline，PBS)(武漢博士德生物工程有限公司);抗酸指甲油(OPI公司，美國);8000目金剛石研磨膏(上海新上砂磨料磨具有限公司);OLS4000激光共聚焦顯微鏡(OLYMPUS，日本);HXD-1000TM數字式維氏顯微硬度計(上海泰明光學儀器有限公司);低速金剛石切割機(沈陽科晶自動化設備制造有限公司)。

1．2 實驗用試劑及配制

橙皮甙:將純度≥98%的橙皮甙溶于1 000 mg/L NaOH溶液中，制成橙皮甙濃度為7 000 mg/L的飽和液，然后取適量飽和液，用1 000 mg/L NaOH將其稀釋成3 500 mg/L備用。

脫礦液:50 mmol/L乙酸，1．5 mmol/L磷酸二氫鉀，pH=5．0［3］。

中性緩沖液:HEPES 20 mmol/L，1．5 mmol/L 磷酸二氫鉀，pH=7．0［3］。

NaF溶液的配制:精確稱取分析純NaF，用雙蒸水制成濃度為1 000 mg/L的NaF溶液用于實驗。

1．3 牙本質塊試件制備

從西安交通大學口腔醫(yī)院口腔頜面外科門診收集因阻生而新鮮拔除的第三磨牙30顆(患者均知情同意)，刮除表面附著的軟組織并徹底清洗后，用慢速切割機在流水冷卻下切取牙根，沿長軸方向縱切成厚約1．6 mm的牙本質片;刮除牙髓組織后將其制備成4 mm×3 mm×1．6 mm的牙本質塊60個。60個牙本質塊分別在流水冷卻下用600，1 200，2 000，2 500目碳化硅砂紙依次打磨后，再用8 000目金剛石研磨膏將其表面拋光成鏡面;然后在每個試件中央預留3 mm×2 mm的開窗區(qū)，其余部位均勻涂布抗酸指甲油。

1．4 實驗分組及處理

將60個牙本質塊經基線顯微硬度(SMH1)測試后，按不同預處理液將其隨機分為5組:陰性對照組(雙蒸水)、溶劑對照組(1 000 mg/L NaOH溶液)、陽性對照組(1 000 mg/L NaF溶液)以及兩個實驗組(7 000 mg/L及3 500 mg/L橙皮甙溶液)。然后取各組試件按以下步驟進行pH循環(huán):37℃水浴條件下，先用相應的預處理液浸泡10 min;隨后再用1 ml脫礦液浸泡1 h，使牙體硬組織脫礦;最后放入1 ml中性緩沖液中處理5 min。pH循環(huán)過程中，每一步驟結束后均用雙蒸水徹底沖洗1 min，濾紙吸去多余水分。每天循環(huán)2次，連續(xù)處理7 d;每天均更換1次各組預處理液及中性緩沖液。循環(huán)間期所有試件均浸泡于37℃中性緩沖液中。

1．5 顯微硬度測試

pH循環(huán)處理結束后，從每組中各隨機抽取6個試件，用維氏顯微硬度計分別測定各試件開窗區(qū)表面的顯微硬度值(SMH2)。測定條件為:50 g載荷下維持15 s形成壓痕;每個試件測5個點(各點相距100 μm)，取其平均值作為該試件該次的硬度值。然后計算各組脫礦前后顯微硬度的差值:ΔSMH=SMH1-SMH2。

1．6 脫礦體積測試

取各組所余的pH循環(huán)結束后的6個試件，去除封閉指甲油后用2．5%戊二醛固定4 h;PBS溶液沖洗15 min×3 次，25，50，75，95，100 mL/L 的乙醇溶液梯度脫水(每種濃度各浸泡20 min);然后在環(huán)境溫度下，以開窗區(qū)邊緣為基線，用激光共聚焦顯微鏡觀察各試件的脫礦深度，計算脫礦體積。每個試件開窗區(qū)的每條邊各選2個點(各點相距300 μm)進行脫礦深度測量，掃描區(qū)域均為256 μm2，取平均值作為該試件該次的脫礦深度，脫礦體積=3 000 μm ×2 000 μm ×脫礦深度。

1．7 統(tǒng)計學分析

應用SPSS 18．0統(tǒng)計軟件對SMH1、ΔSMH 及脫礦體積±s進行單因素方差分析，兩兩比較用Student-Newman-Keuls檢驗，檢測水準 α=0．05(雙側)。

2 結果

2．1 脫礦前后各預處理組樣本SMH的變化

pH循環(huán)處理前，各組牙本質的表面顯微硬度(SMH1)差異無統(tǒng)計學意義(P＞0．05);分別用相應的預處理液處理后，再用脫礦液處理1 h，各組牙本質的表面顯微硬度(SMH2)均較基線硬度值(SMH1)降低，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0．05)，說明脫礦液導致牙本質脫礦;各組顯微硬度的降低程度(ΔSMH)以7 000 mg/L HPN預處理組最低，依次為:7 000 mg/L HPN組＜1 000 mg/L NaF組＜1 000 mg/L NaOH組＜3500 mg/L HPN組＜雙蒸水(陰性對照)組，組間兩兩相比，7 000 mg/L HPN和1 000 mg/L NaF兩組間無統(tǒng)計學差異(P＞0．05)，但兩者分別與其他各組相比差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0．05)，而3 500 mg/L HPN、1 000 mg/L NaOH、雙蒸水三組間兩兩相比差異均無統(tǒng)計學意義(P＞0．05，見表1)。

2．2 脫礦后各預處理組脫礦體積比較

不同預處理液處理后的各組牙本質試件經脫礦液處理1 h后，其脫礦體積以1 000 mg/L NaF組最小，依次為:1 000 mg/L NaF組＜7 000 mg/L HPN組＜3 500 mg/L HPN組＜1 000 mg/L NaOH組＜雙蒸水組;各組間兩兩相比，7 000 mg/L HPN和1 000 mg/LNaF兩組間差異無統(tǒng)計學意義(P＞0．05)，但兩者分別與其他各組相比差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0．05)，而3 500 mg/L HPN、1 000 mg/L NaOH、雙蒸水三組間兩兩相比差異均無顯著性意義(P＞0．05，見表2)。各組脫礦后表面形貌見圖1，掃描面積相同，1 000 mg/L NaF組和7 000 mg/L HPN組的脫礦區(qū)域較其他各組表淺。

表1 各處理組pH循環(huán)前后SMH比較(n=6，±s)Table 1 Changes of SMH before and after pH cycling in five groups(n=6，±s)

表1 各處理組pH循環(huán)前后SMH比較(n=6，±s)Table 1 Changes of SMH before and after pH cycling in five groups(n=6，±s)

與基線SMH1比較，*P ＜0．05;與雙蒸水組、1 000 mg/L NaOH、3 500 mg/L HPN 組 ΔSMH比較，#P＜0．05

組別 SMH1(基線) SMH2 ΔSMH雙蒸水組 60．47 ±5．77 8．57 ±3．56*52．76 ±3．94 54．70 ±5．05 1 000 mg/L NaOH 組 60．77 ±6．99 8．24 ±4．17* 52．30 ±4．16 1 000 mg/L NaF 組 61．46 ±4．37 17．47 ±5．52* 44．04 ±3．28#7 000 mg/L HPN 組 61．17 ±6．70 18．12 ±4．96* 42．73 ±4．39#3 500 mg/L HPN 組 60．05 ±4．40 7．29 ±3．40*

表2 各處理組脫礦體積比較(n=6，±s)Table 2 Comparison of mineral loss among five groups(n=6，±s)

表2 各處理組脫礦體積比較(n=6，±s)Table 2 Comparison of mineral loss among five groups(n=6，±s)

與其雙蒸水組、1 000 mg/L NaOH組、3500 mg/L HPN組比較，*P ＜0．05

礦體積(μm3)×108±2．834×107×108±0．969 ×107×108±0．315 ×107*×108±0．330 ×107*3 500 mg/L HPN 組 0．978 ×108±1．187 ×107

圖1 各組脫礦后表面形貌(激光共聚焦顯微鏡，×1 000)Figure 1 Surface of root dentin after demineralization under laser scanning confocal microscope(×1000)

3 討論

根面齲的進展過程包括兩個階段:①附著于根面的菌斑生物膜內特定的細菌(變形鏈球菌及放線菌)與食物成分相互作用，細菌代謝唾液或食物來源的碳水化合物產生毒力因子，導致菌斑生物膜酸化，這種持續(xù)的酸性環(huán)境最終引起牙體硬組織脫礦，并導致膠原纖維暴露形成淺碟樣損害［4］;②宿主來源的基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)可水解脫礦后暴露的膠原纖維，造成有機質崩解，加速齲病進展［5］。傳統(tǒng)的充填術可以恢復病變部位的缺損，但僅針對已經出現的齲洞，而且根面齲的形態(tài)不易形成良好的固位形，充填效果不佳，治療及維護費用昂貴。自20世紀中期始，越來越多的口腔學者強調促進齲病的預防以及早期醫(yī)療干預的重要性，可以同時滿足微創(chuàng)牙科(minimal invasive dentistry，microdentistry，MI)和節(jié)約保健費用的需求。

利用天然產物防治齲病的有效性、低毒性及不產生耐藥性已為循證醫(yī)學證明，近年來成為齲病防治領域關注的焦點。橙皮甙是柑桔果實中提取的生物黃酮類化合物［7］，屬于多酚類化合物，具有抗癌、抗氧化、免疫調節(jié)、抗菌消炎、防止動脈硬化和心肌梗死等多種生物學活性［7-11］。近年來有學者將橙皮甙應用于口腔領域，發(fā)現橙皮甙能穩(wěn)定膠原纖維，可有效促進牙本質的再礦化過程［2］;橙皮甙結合黏接劑處理牙本質表面，可提高牙面的硬度及彈性模量［12］。以上研究結果提示，橙皮甙的這種特性對根面齲具有預防和治療作用，值得研究。

本實驗結果顯示，根方牙本質樣本經脫礦液處理后，其表面顯微硬度值顯著降低，脫礦體積顯著增加;提示脫礦液具有溶解羥基磷灰石，使根方牙本質脫礦的作用。脫礦液浸泡前分別用1 000 mg/L NaF溶液或7 000 mg/L HPN溶液對樣本進行預處理，則可使其SMH值的降低程度(ΔSMH)和脫礦體積顯著減輕，與陰性對照組相比差異有統(tǒng)計學意義(P＜0．05)，說明使用 1 000 mg/L NaF 和 7 000 mg/L HPN預處理能明顯抑制脫礦液對根方牙本質的酸蝕脫礦作用，從而提高其耐脫礦能力。溶劑對照組ΔSMH和脫礦體積與陰性對照組相比無顯著性差異(P＞0．05)，排除了以NaOH作為溶劑對HPN耐脫礦作用的影響。研究表明，NaF具有抑制牙體硬組織脫礦并促進其再礦化的作用［13，14］，這是由于羥基磷灰石溶解后釋放的離子與氟離子反應形成氟磷灰石，其抗酸溶解能力較強［15］，阻止了牙體硬組織進一步脫礦;同時氟離子還可與解離出的鈣離子結合形成氟化鈣，從而阻止鈣的繼續(xù)喪失［16］。

7 000 mg/L HPN預處理后，其牙本質的SMH值降低程度(ΔSMH)及脫礦體積均與陽性對照組無顯著差異，提示HPN飽和液預處理也可以降低羥基磷灰石的溶解度，增強根方牙本質對脫礦液酸蝕作用的抵抗能力，其效果與NaF預處理相當。但是，HPN預處理提高根方牙本質抗酸能力的機制與NaF不盡相同，這可能與HPN能夠穩(wěn)定裸露的膠原纖維有關。當牙本質表層的羥基磷灰石溶解后，如果裸露的有機基質完整性能得以保持，就可以阻止脫礦區(qū)鈣離子和磷酸根離子進一步擴散，從而阻礙脫礦進展［2］。因此，齲損脫礦部位牙本質有機質層的相對完整性，對限制早期齲損區(qū)域的進展，以及防止病損區(qū)域進一步脫礦具有極為重要的意義［17］。牙本質基質的主要成分和支架是Ⅰ型膠原纖維［18］。研究表明HPN可能具有交聯(lián)性［2］，能促進膠原纖維的交聯(lián)來增韌膠原，從而穩(wěn)定了牙本質的支架結構并形成機械屏障，該屏障可阻止礦物質繼續(xù)擴散，最終提高牙本質的耐脫礦能力。目前關于HPN的具體交聯(lián)機制尚不明確，但學者們推測可能與葡萄籽提取物——原花青素(一種天然交聯(lián)劑)的作用近似;HPN和原花青素均為酚類黃酮化合物，基本結構單元相近，都具有一個苯并二氫吡喃環(huán)［12］。大量研究已證實，采用原花青素作為牙本質交聯(lián)劑，能夠顯著地增加牙本質有機質的機械性能［19，20］。這是由于原花青素能與膠原形成多種結合鍵，如共價鍵、離子鍵、氫鍵等，并形成疏水的微環(huán)境，從而起到增強膠原的機械性能、提高牙本質耐脫礦能力的作用［21］。同時膠原的進一步交聯(lián)，可減少基質金屬蛋白酶的作用位點，進而提升了膠原的耐酶解能力，進一步穩(wěn)定膠原［22］。然而關于HPN具體的交聯(lián)機制仍有待進一步實驗研究證實。

3 500 mg/L HPN預處理組的ΔSMH值和脫礦體積均顯著低于陽性對照組和7 000 mg/L HPN組，與陰性對照組間無顯著差異，說明濃度為3 500 mg/L的HPN預處理在提高根方牙本質耐脫礦能力方面作用甚微。提示，在本實驗條件下，使用HPN飽和液預處理，根方牙本質耐酸蝕脫礦的作用最好。

增強牙體硬組織的抗酸能力以及促進早期齲損脫礦部位再礦化，一直是齲病預防及治療的重點。本研究結果顯示，橙皮甙飽和溶液可顯著降低脫礦液的酸蝕脫礦作用，提高根方牙本質的耐脫礦能力，提示橙皮甙在預防根面齲方面有較好的應用前景。但是，其具體的耐脫礦機制，是否具有促進根面齲再礦化的作用，生物安全性如何，能否作為添加劑用于牙膏、護牙素或漱口水等商品中，目前尚不明確，仍有待進一步實驗研究證明。

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