沈 劍，王伯良，嚴(yán)琦敏，郭學(xué)剛(第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院急診科，西安 7008;解放軍第醫(yī)院肝膽外科;第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院消化病醫(yī)院6科;通訊作者，E-mail:xuct00@qq．com)

原發(fā)性膽囊癌(primary gallbladder cancer)作為原發(fā)于膽囊的惡性腫瘤，臨床相對(duì)少見，但惡性程度高，預(yù)后極差，即使手術(shù)治療其5年生存率也只有30%［1-3］。對(duì)膽囊癌發(fā)生發(fā)展過程中的生物學(xué)行為研究較少，其本質(zhì)還未被充分認(rèn)識(shí)［2-4］。趨化因子CXCL12和它的自身受體CXCR4形成CXCL12-CXCR4生物學(xué)軸(CXCL12-CXCR4 biological axis)在肺癌、膽囊癌、結(jié)腸癌等的發(fā)生發(fā)展，以及浸潤和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮著重要作用［5-7］，但這一生物軸在膽囊癌中作用機(jī)制還不明確［8］。我們通過測(cè)定膽囊癌組織中CXCL12和CXCR4表達(dá)，并探討其臨床意義。

1 對(duì)象和方法

1．1 對(duì)象

選擇2010-01～2014-12第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院和解放軍第323醫(yī)院手術(shù)切除病理證實(shí)的原發(fā)性膽囊癌標(biāo)本132例，男性74例，女性58例，年齡35-76 歲，平均(56．7 ±16．6)歲，包括淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移46例和無淋巴轉(zhuǎn)移86例。全部患者術(shù)前均未進(jìn)行抗腫瘤治療(放化療、免疫治療等)。膽囊癌Nevin分期為Ⅰ-Ⅲ期46例，Ⅳ-Ⅴ期86例;組織病理學(xué)為腺癌102例，其他30例，其中高分化48例，中分化30例，低分化54例。對(duì)照組標(biāo)本選擇正常膽囊24例，男性14例，女性10例，年齡45-66歲，平均(52．7 ±8．6)歲。

1．2 試劑

檢測(cè)所用試劑包括兔抗人CXCL12單克隆抗體(RD公司，美國)，鼠抗人CXCR4單克隆抗體(Abcam公司)，免疫組織化學(xué)ElivisionTMPlus檢測(cè)試劑盒為福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司。所有操作均按照試劑盒說明并結(jié)合實(shí)際進(jìn)行。

1．3 方法

用免疫組織化學(xué)確定膽囊癌和正常膽囊標(biāo)本中CXCL12和CXCR4表達(dá)。①膽囊癌標(biāo)本和正常標(biāo)本按要求進(jìn)行切片脫蠟和水化;②在pH6．0枸櫞酸鹽緩沖液中加熱修復(fù)15 min，溫度在95-98℃，然后在過氧化氫溶液(0．3%)室溫下孵育10 min;③加入一抗(CXCL12稀釋為4 μg/ml，CXCR4稀釋為5 μg/ml)，孵育過夜;④滴加聚合物增強(qiáng)劑，室溫下孵育20 min;⑤滴加酶標(biāo)抗鼠/兔聚合物，室溫下孵育30 min，再滴加新鮮配制的二氨基聯(lián)苯胺(DAB)溶液顯色，蘇木素復(fù)染，鹽酸酒精分化;⑥用已知陽性切片作對(duì)照，用磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗作空白對(duì)照，用正常膽囊組織標(biāo)本作陰性對(duì)照。

1．4 結(jié)果判定

膽囊組織細(xì)胞的胞質(zhì)和胞膜內(nèi)出現(xiàn)棕黃色著色顆粒為CXCL12和CXCR4陽性細(xì)胞，評(píng)分包括陽性腫瘤細(xì)胞百分?jǐn)?shù)和染色深淺兩方面。判斷結(jié)果必須結(jié)合SP法染色強(qiáng)度(陽性)和陽性細(xì)胞百分比。①染色強(qiáng)度:陰性(-)為不著色計(jì)0分，弱陽性(+/-)為淡棕黃色計(jì)1分，弱陽性和強(qiáng)陽性之間(+)計(jì)2分，深棕黃色為強(qiáng)陽性(++)計(jì)3分。②陽性細(xì)胞百分比計(jì)分方法:＜5%為0分，5%-30%為1分，30%-60%為2分，＞60%為3分。③結(jié)果判斷:染色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞分值之和為最后分值，0-2分為陰性(-)，3-6分為陽性(+)。

1．5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 13．0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)數(shù)資料分析用χ2檢驗(yàn)，相關(guān)性分析用Spearman分析。P＜0．05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 CXCL12和CXCR4蛋白表達(dá)

在膽囊癌細(xì)胞質(zhì)中CXCL12陽性染色，其染色顆粒表現(xiàn)為淺黃色或棕黃色;CXCR4蛋白表達(dá)也位于膽囊癌細(xì)胞質(zhì)中，其表達(dá)呈棕黃色(見圖1)。在膽囊癌組織中CXCL12和CXCR4表達(dá)陽性表達(dá)率分別為69．7%和62．1%，分別高于正常膽囊表達(dá)分別為16．7%(χ2=12．284，P ＜0．01)和 8．3%(χ2=13．642，P＜0．01)，膽囊癌中兩者表達(dá)明顯高于正常膽囊(P均＜0．01)。此外，CXCL12 和 CXCR4 表達(dá)與Nevin分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)(P＜0．05，見表1)。

圖1 膽囊癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移時(shí)CXCL12和CXCR4蛋白表達(dá)(SP，×100)Figure 1 Expression of CXCL12 and CXCR4 in gallbladder carcinoma patients with lymph node metastasis(SP，×100)

2．2 CXCL12與CXCR4蛋白表達(dá)的相關(guān)性

CXCL12與CXCR4表達(dá)通過Spearman相關(guān)性分析，結(jié)果表明兩者存在一定相關(guān)性(r=0．438，P＜0．05)。高分化48例，中分化30例，低分化54例。

3 討論

趨化因子蛋白家族中的CXCL12是一個(gè)小分子細(xì)胞因子，也稱基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1(SDF-1)，包括SDF-1α/CXCL12a和 SDF-1β/CXCL12b。趨化因子的結(jié)構(gòu)特殊，主要由4個(gè)半胱氨酸殘基組成兩對(duì)雙硫鍵構(gòu)成，這種結(jié)構(gòu)對(duì)淋巴細(xì)胞有強(qiáng)烈的趨化作用并在發(fā)育中起重要作用［5-7］，在免疫系統(tǒng)發(fā)育過程發(fā)揮作用是由于CXCL12對(duì)淋巴細(xì)胞具有強(qiáng)烈趨化作用引起。CXCL12在腦、心、肺、肝、腎等組織中都有表達(dá)［3-5］，也對(duì)這些部位均具有調(diào)控作用［2，8］。CXCL12通過CXCR4受體活化細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳遞使膜受體信號(hào)向細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)，這一過程可以通過PI3K/AKT(PI3K/AKT通路實(shí)現(xiàn)的，這一過程是調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡、自噬和發(fā)生發(fā)展，以及一些重要基因表達(dá)，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞周期蛋白變化和細(xì)胞增殖［8-11］。

CXCL12和CXCR4在腫瘤組織中的表達(dá)已受到廣泛重視，它們所構(gòu)成的耦聯(lián)分子影響腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)過程、遷移和增殖，從而對(duì)腫瘤消長(zhǎng)發(fā)揮著重要作用［13-16］。CXCL12在卵巢癌、胰腺癌、腦膠質(zhì)瘤等腫瘤中表達(dá)已有報(bào)道［4］，同時(shí)也可以在腫瘤易發(fā)生轉(zhuǎn)移的組織(肺、肝、骨骼等)中也有表達(dá)［15-18］。膽囊癌病變程度或分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移都可導(dǎo)致CXCL12蛋白表達(dá)的變化，腫瘤晚期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移時(shí)CXCL12表達(dá)升高，表明CXCL12在參與膽囊癌發(fā)展過程有重要作用，而CXCR4則在腫瘤組織中的表達(dá)差異導(dǎo)致個(gè)體腫瘤的不同發(fā)展方向［4-6］，本研究也支持這一結(jié)果。

表1 CXCL12和CXCR4在膽囊癌中的陽性表達(dá) 例(%)Table 1 Expression of CXCL12 and CXCR4 in gallbladder carcinoma cases(%)

研究表明［19-21］，CXCL12和 CXCR4對(duì)腫瘤的作用可以通過絲裂原活化蛋白激酶和磷脂酰肌醇3激酶信號(hào)途徑影響癌細(xì)胞遷移，也可以通過自分泌和旁分泌影響癌細(xì)胞生長(zhǎng)［10-12，22-24］。Schioppa 等［13］則認(rèn)為缺氧誘導(dǎo)因子-1α、核轉(zhuǎn)錄因子以及腫瘤抑制蛋白可能上調(diào)CXCL12及CXCR4的表達(dá)水平，從而影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展。腫瘤異常增殖以及過度生長(zhǎng)均可使瘤內(nèi)出現(xiàn)嚴(yán)重缺氧，此時(shí)可以通過調(diào)節(jié)代謝克服氧氣供給和改善營養(yǎng)物質(zhì)，同時(shí)發(fā)生某些基因表達(dá)改變影響腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移［14，15］，研究表明腫瘤過程中局部缺氧引起CXCR4表達(dá)可能是抑制腫瘤細(xì)胞凋亡從而促進(jìn)腫瘤的增生和轉(zhuǎn)移［15，16，24-26］。

我們研究表明，CXCL12和CXCR4在原發(fā)性膽囊癌中有明顯表達(dá)，且與Nevin分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，提示測(cè)定它們對(duì)原發(fā)性膽囊癌的診斷可能具有一定臨床意義。

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